Variación transcripcional en Babesia gibsoni (aislado de Wuhan) entre cultivos in vivo e in vitro en etapa sanguínea

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 268 (2023) Citar este artículo

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Babesia gibsoni, el agente causante de la babesiosis canina, pertenece al filo Apicomplexa. El desarrollo de la tecnología de cultivo in vitro ha impulsado el progreso de la investigación en diversos tipos de estudios ómicos, incluido el análisis transcriptómico de Plasmodium spp. entre ambientes in vitro e in vivo, lo que ha impulsado la observación de antígenos de diagnóstico y el desarrollo de vacunas. Sin embargo, no se dispone de información sobre Babesia spp. Se podría obtener a este respecto, lo que dificulta en gran medida una mayor comprensión del crecimiento y desarrollo del parásito en la etapa sanguínea.

En este estudio, se observaron cambios considerables en la morfología y la infectividad de B. gibsoni cultivada in vitro (aislado de Wuhan) en comparación con los parásitos in vivo. En base a estos cambios, se recopiló B. gibsoni (aislado de Wuhan) de cultivos tanto in vivo como in vitro, seguido de extracción de ARN total y secuenciación del transcriptoma de Illumina. Los genes expresados diferencialmente (DEG) adquiridos se validaron mediante qRT-PCR y luego se anotaron funcionalmente a través de varias bases de datos. El gen con mayor regulación positiva después del cultivo in vitro se clonó a partir del genoma de B. gibsoni (aislado de Wuhan) y se caracterizó mediante transferencia Western y ensayo de inmunofluorescencia indirecta para detectar la forma nativa y la localización celular.

Mediante cultivos de laboratorio, se observaron múltiples formas de parásitos y se descubrió que la infectividad de los parásitos cultivados in vitro en perros era menor. Sobre la base de estos cambios, se realizó la secuenciación del transcriptoma de Illumina, que mostró que 377 unigenes estaban regulados al alza y 334 unigenes estaban regulados a la baja. En particular, se evaluó una familia de factores de transcripción AP2, esencial para todas las etapas de desarrollo de los parásitos, y se probaron los cambios transcripcionales en estos miembros de la familia. Por lo tanto, se seleccionó el nuevo gen del factor de transcripción AP2 (BgAP2-M) con la mayor expresión regulada positivamente después de la adaptación in vitro. Este gen comprende un marco de lectura abierto (ORF) de 1989 pares de bases que codifican una proteína de longitud completa de 662 aminoácidos. BgAP2-M contiene un dominio AP2 y un dominio conservado ACDC, que pueden estar involucrados en la biología nuclear de los parásitos. Los anticuerpos policlonales preparados contra los péptidos BgAP2-M detectaron además un tamaño nativo de ~73 kDa y se localizaron en los núcleos de B. gibsoni.

Este estudio presenta por primera vez un análisis exhaustivo del transcriptoma de B. gibsoni in vivo e in vitro, lo que contribuye a una comprensión detallada de los efectos de los cambios ambientales en el crecimiento y desarrollo de los parásitos en la etapa sanguínea. Además, también proporciona una investigación más profunda de los diferentes miembros de la familia del factor de transcripción ApiAP2 como reguladores de diversas etapas de la vida en Babesia spp.

Las especies de Babesia son hemoprotozoos intraeritrocíticos obligados que se clasifican taxonómicamente en el filo Apicomplexa, clase Piroplasmea, orden Piroplasmida y familia Babasidae [1,2,3]. Babesia gibsoni es un parásito hemoprotozoario que causa síntomas típicos de babesiosis canina, como anemia hemolítica, hemoglobinuria, shock hipotensivo y muerte [4,5,6]. Este organismo también se transmite por vía transovárica por Haemaphysalis longicornis, que está ampliamente distribuido en zonas silvestres montañosas [7,8,9,10].

Se han establecido sistemas de cultivo in vitro de laboratorio para varios parásitos apicomplejos, incluidos Babesia bovis, B. bigemina, B. gibsoni, B. orientalis, Plasmodium falciparum y P. knowlesi [11,12,13,14,15]. Debido a varios factores ambientales in vitro, incluidos factores físicos, nutricionales e inmunológicos, que son distintos de los in vivo, los parásitos tienden a mostrar cambios visibles y significativos en morfología, infectividad y virulencia. Por ejemplo, en el aislado de B. gibsoni Oita, el cultivo in vitro a largo plazo dio como resultado parásitos más grandes y multiformes en los eritrocitos del huésped y una menor infectividad del parásito en perros [13, 16]. Por lo tanto, se cree que los cambios transcripcionales más profundos son provocadores y significativos. Sin embargo, estos cambios en los genes afectados por el cultivo in vitro se han investigado tanto en P. falciparum como en P. knowlesi [17,18,19,20]. En ocasiones, estas alteraciones significan la adaptación de los parásitos al entorno circundante, lo que produce una mejor supervivencia y propagación [21]. Por ejemplo, se han identificado algunos genes de la etapa sexual (antígeno gameto 27/25) y otros relacionados con la invasión y el crecimiento de la etapa asexual (MSP7, DOC2 y CLAMP) con variaciones de transcripción relativamente grandes porque es mucho menos probable que se transmitan. a nuevos mosquitos vectores y es más probable que invadan los eritrocitos del huésped en entornos in vitro [17, 19]. En particular, varios factores de transcripción ApiAP2 también experimentaron cierto grado de cambio transcripcional. Se determinó que esta familia de proteínas, con uno a tres dominios de unión al ADN, es la familia de factores de transcripción más grande en organismos apicomplejos y regula con precisión todas las etapas de desarrollo de los parásitos [22, 23]. En P. falciparum, se ha documentado bien que dos factores de transcripción AP2, PF3D7_1222600 (PfAP2-G) y PF3D7_1222400 (PfAP2-G4), tienen mutaciones sin sentido de pérdida de función con codones de parada prematuros, lo que lleva a una tremenda represión de la transcripción genética durante la gametocitogénesis. . Se detectó otro factor de transcripción AP2 (PF3D7_1342900, PfAP2-HS) con tres mutaciones sin sentido, todas las cuales residían aguas arriba de los dominios AP2 predichos y truncaban la proteína de longitud completa. Estas mutaciones afectadas por la transcripción en PfAP2-HS probablemente fueron el resultado de una mayor tolerancia a las fluctuaciones de temperatura en ambientes in vitro [18]. Además, estudios recientes han observado niveles elevados de transcripción de un gen AP2 de función desconocida (PF3D7_0420300), que puede estar implicado en la reproducción asexual [19].

Desde el establecimiento del cultivo in vitro en especies de apicomplejos hace varias décadas, la comprensión de la biología del parásito se ha acelerado enormemente y se han logrado algunos avances en el desarrollo de vacunas y la identificación de objetivos farmacológicos. En Plasmodium spp., se han realizado estudios transcriptómicos en parásitos de entornos in vitro e in vivo y se han identificado DEG significativos que pueden afectar múltiples procesos biológicos. Sin embargo, hay poca información disponible sobre Babesia spp. Aquí, primero realizamos la secuenciación del transcriptoma de cultivos in vivo e in vitro de B. gibsoni (aislado de Wuhan) en la etapa sanguínea en función de los cambios en la morfología, infectividad y virulencia del parásito. Así, se identificaron genes con expresión significativamente diferencial a nivel de transcripción.

Además, la familia del factor de transcripción ApiAP2 se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), lo que llevó a la observación de un nuevo gen AP2 (BgAP2-M) con la mayor regulación positiva después del cultivo in vitro. La expresión y localización de BgAP2-M se estudiaron mediante transferencia Western y ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA), revelando su importante papel en la etapa sanguínea. En conjunto, nuestra investigación proporciona una visión integral de la variación transcripcional en B. gibsoni (aislado de Wuhan) en la transición de entornos in vivo a in vitro y será de gran ayuda en la detección de antígenos candidatos para uso diagnóstico futuro.

Se compraron cuatro hembras beagle (de 1 año) en el Centro de animales de laboratorio de Anlu y se confirmó que estaban libres de Babesia natural mediante examen microscópico de frotis de sangre teñidos con Giemsa y PCR. Los animales recibieron cantidades estándar de comida y agua potable diariamente. Se utilizaron dos beagles como donantes de eritrocitos y suero. Después de la esplenectomía, se inocularon otros dos beagles experimentales con 2 × 108 eritrocitos infectados con B. gibsoni (aislado de Wuhan) in vivo e in vitro. La temperatura rectal se registró diariamente y se recogieron muestras de sangre diariamente para controlar la parasitemia. Una vez que superó el 20%, se recogieron muestras de sangre venosa para su posterior análisis.

Según protocolos previamente establecidos (no publicados) en el laboratorio, el medio de cultivo fue RPMI 1640 (Gibco) que contenía piruvato de sodio 0,9 mM, NaHCO3 24 mM con un pH de 6,9, penicilina G a 200 unidades/ml, estreptomicina a 200 μg/ml. , e incluye un 20% de suero canino para cultivo in vitro. A los eritrocitos de perros normales se les suministró anticoagulante EDTA-K2 de perros donantes. La sangre completa se lavó tres veces con medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediante centrifugación a 500 xg durante 10 minutos a 4 °C y se eliminó la capa de leucocitos. Los eritrocitos de perro lavados se agregaron a un volumen doble de medio RPMI 1640 y se almacenaron a 4 °C para su uso posterior. Se recogió suero de perro normal de perros donantes y se almacenó a -20 °C hasta su uso. En una placa de cultivo de plástico de 24 pocillos, se suspendieron 100 µl de eritrocitos en 900 µl de medio de cultivo para alcanzar un volumen celular empaquetado (PCV) final del 10%. Cada 24 h, se eliminaron aproximadamente 800 μl de sobrenadante de cultivo sin alterar los eritrocitos sedimentados y se reemplazaron con medio refrescante. Se realizó diariamente un examen microscópico de los eritrocitos sedimentados para controlar la parasitemia. Los subcultivos se prepararon cada 3 a 4 días. Cuando la parasitemia alcanzó el 8%, se transfirió una mezcla de 100 µl de medio de cultivo, que contenía aproximadamente 8 × 106 eritrocitos infectados, a un pocillo nuevo que contenía una suspensión de 800 µl de medio de cultivo fresco y 100 µl de eritrocitos de perro normales. Los parásitos se cultivaron en una incubadora que contenía 5% de CO2 a 37 °C. Babesia gibsoni (el aislado de Wuhan) se cultivó de manera estable durante 150 pases.

Se recogieron eritrocitos infectados con B. gibsoni sedimentados (aislado de Wuhan) in vivo (P0) e in vitro (P150, 150 generaciones). Brevemente, las muestras de sangre se centrifugaron a 500 xg durante 10 minutos a 4 °C. Luego se añadió un volumen 10 veces mayor de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) (Biosharp, Hefei, China) a los eritrocitos recolectados, seguido de una incubación a 4 °C durante 15 minutos. Los lisados se filtraron a través de una membrana de 3 μm (Whatman, Florham Park, Nueva Jersey, EE. UU.) y se centrifugaron a 10.000 xga 4 ° C durante 15 minutos para obtener gránulos de parásitos enriquecidos.

Los gránulos de parásitos recolectados se resuspendieron en 1 ml de reactivo TRIzol® (TransGen Biotech, Beijing, China) y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Para extraer el ARN, se agregaron 200 μl de cloroformo por ml de TRIzol a los sobrenadantes de la muestra, seguido de un vórtice de 30 s y una incubación a 4 °C durante 5 min. Las muestras se centrifugaron a 10.000 xg a 4 °C durante 15 minutos para separar las fases. La fase acuosa superior se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga que contenía un volumen igual de alcohol isopropílico, seguido de una incubación estática durante 10 minutos. Para aislar el ARN total, las muestras se centrifugaron a 10.000 xg a 4 °C durante 15 minutos y se eliminó el sobrenadante. Los sedimentos de ARN enriquecido se mezclaron con 1 ml de etanol al 75% y se centrifugaron a 10.000 xg a 4 °C durante 15 minutos. Después de que los sedimentos de ARN se disolvieran en 30 µl de agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC), se realizó el control de calidad utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific) y un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies).

La construcción de la biblioteca de secuenciación de ARN (RNA-Seq) se realizó utilizando Novogene. Se enriqueció ARN poli(A)+ (ARN mensajero [ARNm]) usando perlas magnéticas con oligo (DT) y se fragmentó usando un tampón de fragmentación. Después de la síntesis de ADN complementario monocatenario (ADNc) con hexámeros aleatorios, se utilizaron tampón, dNTP, ADN polimerasa I y ARNasa H para sintetizar ADNc bicatenario (ds). El ADNc ds adquirido se purificó con perlas AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.), seguido de extremos reparados, extremos 3 'adenilados y un adaptador con código de barras ligado al extremo. Los fragmentos se enriquecieron mediante PCR para obtener las bibliotecas finales, seguido de una cuantificación primaria utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad Qubit® 2.0 dsDNA (Thermo Fisher Scientific). Las bibliotecas diluidas se analizaron con precisión mediante qRT-PCR y se dimensionaron utilizando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). Las bibliotecas de RNA-Seq multiplexadas se secuenciaron utilizando lecturas de extremos emparejados de 150 pares de bases (pb) en una plataforma NovaSeq 6000 (Illumina).

Se obtuvieron datos limpios en el formato FASTQ eliminando lecturas que contenían un adaptador, poli-N y lecturas de baja calidad (< Q20) usando Cutadapt (versión 1.15). Posteriormente, se calcularon y validaron la tasa efectiva, la tasa de error, Q20, Q30 y el contenido de guanina-citosina (GC) de los datos limpios. Se ensamblaron lecturas limpias de alta calidad utilizando Trinity (versión 2.12.0) [24] con K-mer = 25 pb para obtener las transcripciones y unigenes ensamblados. Los parámetros del genoma de B. gibsoni (no publicado) se configuraron en el software Trinity para adquirir secuencias unigene más limpias sin transcripciones del huésped. La anotación de la función genética se basó en varias bases de datos públicas en línea, incluidas las secuencias de proteínas no redundantes (NR) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG), la ontología genética (GO), eggNOG (genealogía evolutiva). de genes: grupos ortólogos no supervisados), bases de datos Swiss-Prot y Pfam.

Las secuencias unigene ensambladas se mapearon con lecturas limpias utilizando el software RSEM (modelo de ecuación estructural recursiva) (parámetros predeterminados) [25] para estimar los niveles de expresión de genes e isoformas. Los DEG se analizaron utilizando el software DESeq2 (versión 1.32.0). Los criterios de valor ajustado de P <0,05 [26] y |log2FoldChange|> 1 se establecieron para detectar DEG significativos. Se utilizó el software TransDecoder (versión 5.5.0) para identificar las regiones codificantes candidatas dentro de las secuencias de transcripción. EggNOG-mapper v2 (http://eggnog-mapper.embl.de/) se utilizó en línea para la anotación funcional y la predicción de dominio de marcos de lectura abiertos (ORF) candidatos, incluida la anotación de términos GO y el enriquecimiento de la ruta KEGG.

Se seleccionaron al azar varios genes para confirmar la precisión de los datos del transcriptoma analizados mediante qRT-PCR. El ARN se aisló mediante el mismo método descrito anteriormente. Se utilizó TURBO DNase (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) para eliminar completamente la contaminación del ADN restante en las muestras de ARN extraídas. Las relaciones de concentración y absorbancia para 260/280 nm y 260/230 nm de ARN postratamiento se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). Se transcribió inversamente una cantidad de 400 a 500 ng de ARN total de cada preparación de parásito en ADNc utilizando un kit de reactivos PrimeScript RT con borrador de ADNg (ADN genómico) (TaKaRa Bio). La qRT-PCR se llevó a cabo utilizando ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, China) en un sistema qRT-PCR QuantStudio®5 (Applied Biosystems, EE. UU.). Se diseñaron cebadores específicos utilizando el software Clone Manager. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) fue el gen de referencia para normalizar la expresión del gen diana. Se utilizó el método 2−ΔΔCt para calcular el nivel de expresión relativo de unigenes [27].

El gen BgAP2-M se amplificó a partir de ADN genómico y ADNc utilizando cebadores específicos. La secuencia de aminoácidos (aa) de BgAP2-M se tradujo utilizando ORF Finder (//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder). Se utilizó la herramienta de investigación de arquitectura modular simple (SMART) para predecir los dominios conservados en la secuencia de aa BgAP2-M [28]. La señal de localización nuclear (NLS) se predijo utilizando NLStradamus [29]. Se realizaron múltiples alineamientos de secuencias de proteínas utilizando ClustalW [30]. Se utilizó el software MEGA7 para el análisis filogenético de BgAP2-M entre homólogos de otras especies de apicomplejos, a saber, B. bovis, B. bigemina, B. divergens, B. ovata, B. microti, Theileria annulata, P. falciparum, P. yoelii. y P. berghei [31]. SWISS-MODEL se utilizó para el modelado de homología de estructura terciaria del dominio AP2 de BgAP2-M [32].

Se sintetizaron péptidos que oscilaban entre 12 y 15 aa basándose en la secuencia de proteínas de BgAP2-M de la siguiente manera: MPDKRQRRSSRKLS (288–302 aa) y KQYTSNLTDEQKSHR (531–545 aa). Se inmunizaron dos conejos blancos de Nueva Zelanda con péptidos conjugados con hemocianina de lapa californiana (KLH), seguidos de seis inoculaciones de refuerzo a intervalos de 2 semanas. Los títulos de suero inmunológico se evaluaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y los conejos fueron desangrados 10 días después de la última inoculación. Se utilizaron anticuerpos policlonales purificados para la posterior inmunotransferencia e IFA.

La proteína del parásito total lisada con saponina para inmunotransferencia se preparó a partir de muestras de sangre de B. gibsoni in vivo e in vitro, luego se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio al 12,5% (SDS-PAGE) y se transfirió a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). . Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5 % (p/v) en solución salina tamponada con Tris Tween 20 (TBST) durante 2 h a temperatura ambiente y luego se sondaron con anticuerpos primarios contra BgAP2-M y la histona H3 (Proteintech, EE. UU.) a 4 °C durante la noche. Después de tres lavados en TBST, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiado durante 1 hora a temperatura ambiente y se detectaron utilizando reactivos de quimioluminiscencia mejorados (Advansta, EE. UU.).

Se realizaron IFA para detectar la localización de BgAP2-M. Los frotis de B. gibsoni cultivados in vitro se secaron al aire y se fijaron con metanol frío al 95% y acetona al 5% (v/v) a -20 °C durante 20 minutos. Las muestras preparadas se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 minutos y luego se lavaron tres veces con PBS. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos primarios contra BgAP2-M y GAPDH (Proteintech, EE. UU.) diluidos 1:1000 en albúmina sérica bovina (BSA)/PBS al 3% a 4 °C durante la noche, seguido de la incubación con los anticuerpos secundarios Alexa Fluor 594- inmunoglobulina G (IgG) anti-conejo de cabra conjugada e IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) diluidas 1: 1000 en BSA al 3 %/PBS a 37 °C durante 1 h. La tinción nuclear de los parásitos se realizó utilizando Hoechst 33342 a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia.

Babesia gibsoni se cultivó con éxito in vitro en suero al 20%. Después de la división, la parasitemia alcanzó el 10% ± 1,5% el día 3 (Fig. 1A).

Cambios en la parasitemia y morfología de B. gibsoni cultivada in vitro (aislado de Wuhan). A Cambios en la parasitemia de B. gibsoni cultivada in vitro (aislado de Wuhan) dentro de los 3 días posteriores a la división. B Cambios morfológicos en B. gibsoni (aislado de Wuhan) después de la adaptación in vitro. (1–3) Los pequeños parásitos puntiformes, filamentosos y diadas del entorno in vivo. (4–7) Anillos tempranos, anillos maduros, parásitos filamentosos y múltiples del ambiente in vitro. (8–13) Pareja joven, pareja madura, tétradas jóvenes, tétradas maduras, octoploides jóvenes, parásitos octoploides maduros del entorno in vitro. (14, 15) Esquizontes y merozoitos que salen de los eritrocitos. Barras, 5 μm. C La proporción de diferentes formas de parásitos de entornos in vivo e in vitro que contienen un 10% de eritrocitos infectados con B. gibsoni. El análisis estadístico: ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns: no significativo (múltiples pruebas t de Student). Las barras de error representan la media ± desviación estándar (DE) para tres réplicas biológicas.

Las observaciones morfológicas de B. gibsoni (aislado de Wuhan) en el huésped vertebrado mostraron pequeñas formas de anillos y puntos tras la inspección microscópica de las células teñidas con Giemsa (Fig. 1B). Los pequeños parásitos en forma de anillo tenían un tamaño medio de 1,75 ± 0,26 μm × 1,85 ± 0,30 μm. No se observaron formas extracelulares ni múltiples de parásitos, como tétradas u octoploides [13]. Sin embargo, después del cultivo in vitro continuo, se observaron diferentes formas de parásitos, incluidos parásitos en forma de anillo más grandes, parásitos en forma filamentosa, parásitos en forma de díada, parásitos en forma de tétrada, incluso parásitos octoploides y esquizontes (Fig. 1B). Cuando la parasitemia aumentó significativamente, se observaron muchos merozoítos salientes fuera de los eritrocitos del huésped y dos formas diferentes de parásitos crecieron en un eritrocito. En el día 3 de la generación 150, con una parasitemia del 10%, los eritrocitos parasitados con los parásitos en forma de anillo tenían la mayor proporción de todos los eritrocitos infectados. Por el contrario, los eritrocitos parasitados con esquizontes y octoploides tuvieron las proporciones más bajas (Fig. 1C).

La infectividad de los perros se examinó inoculando 2 × 108 eritrocitos infectados por vía intravenosa a partir de muestras de sangre in vivo o cultivos in vitro. Los cambios en la parasitemia y la temperatura a lo largo del tiempo después de la inoculación se muestran en la Fig. 2. La parasitemia de un perro infectado con parásitos in vivo de B. gibsoni (aislado de Wuhan) aumentó lentamente al 3% durante los primeros 10 días. Al mismo tiempo, la temperatura corporal no varió mucho y se mantuvo en el rango de 38,5 a 39,5 °C. Sin embargo, la parasitemia aumentó significativamente la semana siguiente y alcanzó el 21% el día 20, acompañada de una evidente hipertermia. Por el contrario, un perro infectado con B. gibsoni cultivado in vitro de forma continua (aislado de Wuhan) no mostró un alto nivel de parasitemia. Sin embargo, el pico de parasitemia no superó el 2%. La temperatura corporal se mantuvo normal y no superó los 40 °C durante el experimento.

Cambios en la parasitemia y la temperatura después de la infección con 2 × 108 eritrocitos infectados de cultivos de B. gibsoni (aislado de Wuhan) in vivo e in vitro. A Cambios en la parasitemia de dos perros infectados con B. gibsoni (aislado de Wuhan) de cultivos in vivo (rojo) e in vitro (azul), respectivamente. B Cambios en la temperatura de dos perros infectados con B. gibsoni (aislado de Wuhan) de cultivos in vivo (rojo) e in vitro (azul), respectivamente

Durante la adaptación in vitro, las variaciones ambientales influyen significativamente en el desarrollo del estadio sanguíneo del parásito, como los cambios morfológicos o la infectividad de los huéspedes naturales. Para identificar aún más los DEG en función de estas variaciones, generamos datos de RNA-Seq en B. gibsoni en etapa sanguínea (aislado de Wuhan) de cultivos in vivo e in vitro.

Se prepararon bibliotecas de ADNc calificadas a partir de parásitos cultivados in vivo e in vitro de B. gibsoni (aislado de Wuhan) con tres réplicas biológicas. Las lecturas sin procesar fueron de 24,47 a 30,36 Gb después de la secuenciación de Illumina y se depositaron en la base de datos NCBI Sequence Read Archive (SRA). Después de eliminar lecturas no calificadas y de baja calidad, se obtuvieron lecturas limpias con un rango de 23,55 a 29,16 Gb y se utilizaron para el siguiente análisis. Utilizando el software Trinity y la guía del genoma de B. gibsoni (aislado de Wuhan), se ensamblaron 9561 transcripciones y 1340 unigenes para el análisis posterior de DEG.

Se examinaron los DEG para identificar diferencias entre los grupos experimental y de control. Según un conjunto de criterios de valor ajustado de P <0,05 y |log2FoldChange|> 1, se identificaron 711 unigenes como DEG significativos al comparar grupos in vitro e in vivo. Un total de 377 unigenes estaban regulados positivamente y 334 unigenes estaban regulados negativamente (Fig. 3A). Para comprender mejor la función de los DEG significativos, se predijeron marcos de lectura abiertos (ORF) utilizando el software TransDecoder y se sometieron al servicio en línea eggNOG-mapper para un mayor análisis de GO y enriquecimiento de la vía KEGG (Fig. 3B, C) (archivo adicional 1: Tabla S1). Para la anotación funcional de GO, los unigenes se clasificaron en tres categorías GO principales: procesos biológicos, funciones moleculares y componentes celulares. La mayoría de los unigenes fueron asignados a procesos celulares y metabólicos dentro de la categoría de procesos biológicos. A más de 150 unigenes se les asignó actividad catalítica y términos de unión para funciones moleculares. Entre la última categoría, los componentes celulares, los términos denominados célula y partes celulares tenían una mayor proporción de unigenes que cualquier otro término. Para el enriquecimiento de la vía KEGG, todos los unigenes fueron asignados a seis categorías principales: metabolismo, procesamiento de información genética, enfermedades humanas, procesamiento de información ambiental, procesos celulares y sistemas del organismo. Entre estos, el metabolismo, la traducción, la transducción de señales, el crecimiento celular y las vías de adaptación ambiental fueron los principales factores de enriquecimiento que podrían estar relacionados con el desarrollo asexual del parásito durante la adaptación in vitro.

Anotación de términos GO y enriquecimiento de la vía KEGG de DEG significativos entre grupos in vitro e in vivo. Un gráfico de volcán de la expresión relativa de ARNm de parásitos cultivados in vitro continuos de B. gibsoni (aislado de Wuhan) en comparación con los parásitos originales in vivo. Los genes de la izquierda (azul) y de la derecha (amarillo) son DEG regulados negativamente y aumentados, respectivamente. B Anotación de términos GO de DEG significativos. Enriquecimiento de la vía C KEGG de DEG significativos seleccionados

Para verificar la precisión de los datos de RNA-Seq, se realizó qRT-PCR utilizando 10 unigenes seleccionados al azar (Fig. 4). Los resultados de qRT-PCR demostraron patrones de expresión similares a los datos de RNA-Seq, aunque hubo diferencias en el cambio de log2 veces entre los datos de RNA-Seq y qRT-PCR debido a diferencias entre los métodos. Las secuencias de cebadores específicos se enumeran en el archivo adicional 2: Tabla S2.

Validación de datos de RNA-Seq de grupos cultivados in vivo e in vitro de B. gibsoni (aislado de Wuhan). Validación qRT-PCR del nivel de expresión de DEG seleccionados al azar. Los niveles de expresión se normalizaron a GAPDH y se presentaron en relación con los controles.

Se encontraron cambios considerables en los niveles de transcripción de genes implicados en la invasión de los glóbulos rojos por parte del parásito, la virulencia del parásito y el desarrollo de las etapas asexual y sexual (Tabla 1). Encontramos dos genes esenciales que codifican la proteína 2 de la superficie del merozoito y la proteína 14 del micronema que tenían niveles de transcripción más altos en grupos de cultivo in vitro de B. gibsoni (aislado de Wuhan). Estos dos genes pueden estar involucrados en el proceso de invasión de los glóbulos rojos del huésped, lo que coincide con los fenómenos observables de rápida proliferación asexual y alta parasitemia. Además, el análisis de los datos reveló que los niveles de transcripción de un gen que codifica la proteína 3 del cuerpo esférico aumentaron notablemente durante el cultivo in vitro. Estudios anteriores demostraron que la proteína 2 del cuerpo esférico, copia truncada 11 (sbp2t11) de B. bovis, se identificó como un marcador de atenuación específico debido a su patrón consistente de regulación positiva en cuatro cepas atenuadas geográficamente distintas en comparación con sus cepas parentales virulentas [33]. Sin embargo, la proteína del cuerpo esférico 3 de B. gibsoni (aislado de Wuhan) tenía una baja identidad con la proteína del cuerpo esférico 2, copia truncada 11 de B. bovis, por lo que si la SBP3 de B. gibsoni (aislado de Wuhan) está relacionada con la pérdida o ganancia de virulencia necesita ser investigado a fondo. De los DEG en los datos de RNA-Seq, dos genes que codifican la proteína 2 asociada al gancho (hap2) y el factor de transcripción AP2 (AP2-G) se regularon negativamente después de un cultivo in vitro continuo. En P. falciparum, dos genes del factor de transcripción ApiAP2 (PF3D7_1222600 y PF3D7_1222400) implicados en la gametocitogénesis se identificaron previamente en mutantes convergentes sin sentido después de una adaptación in vitro de laboratorio a largo plazo, lo que resultó en etapas más asexuales del crecimiento in vitro del parásito [18]. De manera similar, la disminución de la expresión de genes relacionados con la etapa sexual, incluida la proteína 2 asociada al gancho (hap2) y el factor de transcripción AP2 (AP2-G), después de una adaptación in vitro continua, puede contribuir a la supervivencia y el crecimiento en la etapa asexual. Por el contrario, los huéspedes vertebrados proporcionan a los gametocitos un entorno más natural propicio para la transmisión de garrapatas; por lo tanto, estos genes en etapa sexual tendrían un nivel de expresión más alto en estas condiciones.

Los factores de transcripción ApiAP2 se han identificado funcionalmente en parásitos de la malaria y Toxoplasma. Esta familia de factores de transcripción puede unirse al ADN genómico mediante motivos específicos de secuencia en el promotor y regular cada etapa de desarrollo de los parásitos apicomplejos. En nuestro análisis de datos de RNA-Seq, múltiples genes del factor de transcripción AP2 se regularon hacia arriba o hacia abajo después de una adaptación in vitro continua, lo que revela cambios significativos en el transcriptoma en toda la familia de genes AP2 durante el desarrollo en etapa sanguínea de B. gibsoni (aislado de Wuhan). Presentamos una evaluación sistemática de la familia de genes AP2 en el genoma de B. gibsoni (aislado de Wuhan) (datos no publicados). Algunos genes AP2 se expresaron de manera significativamente diferencial, mientras que otros se obtuvieron usando tBLASTn con especies homólogas, como B. bovis o B. microti. Por lo tanto, 20 genes que codifican proteínas que contienen el dominio AP2 estaban presentes en B. gibsoni (aislado de Wuhan) (Fig. 5).

Representación esquemática de la ubicación y el número de dominios AP2 y ACDC en la familia del factor de transcripción AP2 de B. gibsoni (aislado de Wuhan). Los dominios AP2 y ACDC se muestran en negro y azul, respectivamente. También se indican el ID del gen y la longitud de la proteína de cada factor de transcripción AP2 de B. gibsoni (aislado de Wuhan).

Las secuencias aa de las proteínas AP2 de B. gibsoni (aislado de Wuhan) se predijeron utilizando ORF Finder (//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder). Las longitudes de proteínas previstas fueron muy diversas, oscilando entre 184 y 924 aa. Además, los dominios funcionales conservados se predijeron bioinformáticamente utilizando la herramienta SMART, mostrando diferentes dominios AP2 distribuidos entre los factores de transcripción AP2. La mayoría de estas proteínas AP2 predichas contenían un único dominio AP2, mientras que se identificaron tres miembros con más de un dominio AP2, como dos o tres. Sugerimos que diferentes dominios AP2 de la misma proteína se unan a distintos motivos de ADN y regulen secuencialmente la expresión de diversos genes diana. Anteriormente se identificó un mecanismo regulador similar en P. falciparum, incluido PfAP2-I (PF3D7_1007700) [34]. El factor de transcripción AP2 contiene tres dominios AP2 que pueden reconocer múltiples secuencias de ADN distintas; sin embargo, sólo el tercer dominio es esencial para el desarrollo en etapa sanguínea. Se detectaron dos proteínas AP2 con un dominio ACDC (un dominio coincidente con AP2, principalmente en el extremo C). Este dominio conservado (aproximadamente 80–90 aa) se encuentra principalmente en el extremo C del factor de transcripción AP2 y reside en otras proteínas AP2 del parásito apicomplejo, incluidas B. bovis, P. falciparum y T. gondii [35]. Sin embargo, la participación de este dominio no caracterizado en la biología nuclear requiere más investigación. Además, no se identificaron regiones transmembrana ni péptidos señal en ninguna proteína AP2 de B. gibsoni (aislado de Wuhan).

Dado que esta familia de factores de transcripción sirve como un regulador clave del desarrollo del parásito, realizamos qRT-PCR para analizar los cambios en el nivel de transcripción en toda la familia de genes AP2 (Fig. 6). Las secuencias de cebadores utilizadas para este ensayo se enumeran en el archivo adicional 3: Tabla S3. Dos genes AP2 (BgWH_04g01044 y BgWH_04g00976) estaban significativamente regulados a la baja. Se ha propuesto que estas dos proteínas AP2 pueden regular el desarrollo de la etapa sexual del parásito, de manera similar a AP2-G [36]. Posteriormente, nos centramos en varios genes AP2 regulados positivamente, incluidos BgWH_03g00908 (función desconocida), BgWH_04g00415 (función desconocida), BgWH_03g00279 (homólogo de PfSIP2), BgWH_04g00636 (función desconocida), BgWH_01g00121 (homólogo de PfAP2-O) y BgWH_02g0. 0573 (función desconocida ). En P. falciparum, PfSIP2 se describió previamente como un factor de transcripción asociado a heterocromatina, que se une exclusivamente a regiones subteloméricas y silencia la transcripción de la familia de genes var posteriores [37]. Del mismo modo, recientemente se demostró que PfAP2-O influye en la memoria transcripcional de los genes var en etapas asexuales y contribuye a los ookinetes funcionales que invaden el intestino medio en la etapa de mosquito [38,39,40]. También se demostró que el homólogo de PfAP2-O en Toxoplasma gondii, llamado TgAP2XI-5, impulsa la transcripción de genes cruciales del factor de virulencia [41]. Por tanto, BgWH_03g00279 y BgWH_01g00121 pueden desempeñar funciones importantes en la regulación de la expresión de genes relacionados con la virulencia o la proliferación de parásitos. Curiosamente, se descubrió que un gen AP2 (BgWH_03g00908) tenía niveles de transcripción regulados al alza tres veces después del cultivo in vitro; sin embargo, los homólogos de BgWH_03g00908 en otros parásitos apicomplejos, como P. falciparum (PF3D7_1239200) y B. bovis (BBOV_IV011830), siguen siendo en gran medida desconocidos. Es probable que su expresión significativamente mayor después de la adaptación in vitro ilustre funciones potenciales para regular la merogonía del parásito durante la etapa asexual de desarrollo. Por lo tanto, este factor de transcripción AP2 se seleccionó para una mayor exploración y se denominó BgAP2-M.

Nivel de transcripción relativo de genes de la familia AP2 de B. gibsoni (aislado de Wuhan) entre parásitos en etapa sanguínea cultivados in vivo (rojo) e in vitro (azul) mediante ensayos qRT-PCR. El análisis estadístico: ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns: no significativo (prueba t de Student de dos colas no apareada). Las barras de error representan la media ± DE para tres réplicas biológicas.

Primero clonamos este gen a partir de ADNg y ADNc de B. gibsoni (aislado de Wuhan). El gen BgAP2-M contenía un ORF de 1989 pb sin intrones, que codificaba una proteína prevista de 73 kDa.

La proteína BgAP2-M de longitud completa se alineó con supuestos ortólogos de otras especies de apicomplejos, incluidos B. bigemina, B. ovata, B. divergens, B. bovis, B. microti, T. annulata, P. falciparum y P. berghei, para realizar el análisis filogenético (Fig. 7). BgAP2-M se agrupó en un clado con Bdiv_024900c, BOVATA_016290 y BBBOND_0110120, lo que revela una estrecha relación. BBOV_IV011830 parecía tener una identidad relativamente menor con BgAP2-M que con los ortólogos de B. bigemina, B. ovata y B. divergens. Se han informado casos similares para otros miembros de la familia del factor de transcripción AP2 en B. gibsoni (aislado de Wuhan). Como era de esperar, PF3D7_1239200 y PBANKA_1453700 estaban alineados entre sí y estaban relacionados lejanamente con BgAP2-M, probablemente debido a su orden taxonómico diferente. Además, se presentan diagramas esquemáticos de BgAP2-M y las proteínas relacionadas. BgAP2-M y sus ortólogos en B. bigemina, B. ovata, B. divergens, B. bovis y T. annulata poseen un único dominio AP2 y un dominio ACDC. Por el contrario, BMR1_03g01605, PF3D7_1239200 y PBANKA_1453700 tenían dos dominios AP2 distribuidos en diferentes posiciones de proteínas, lo que indica la unión de distintas secuencias de ADN. Como factores de transcripción funcionales importados al entorno nuclear, los NLS clásicos se predijeron utilizando las herramientas en línea de NLStradamus. La predicción identificó una longitud de NLS de 20 aminoácidos en BgAP2-M y proteínas relacionadas de otros parásitos apicomplejos, lo que implica una posible importación nuclear mediada por NLS.

Análisis filogenético y diagramas esquemáticos de BgAP2-M entre parásitos apicomplejos. El panel izquierdo muestra la relación filogenética de las secuencias de la proteína BgAP2-M que contienen dominios conservados AP2 con homólogos de otros parásitos apicomplejos utilizando el método de unión de vecinos. El árbol está dibujado a escala y las longitudes de las ramas se miden en función del número de sustituciones por sitio. Los números de acceso de proteínas relacionadas están marcados y obtenidos de las bases de datos en línea PiroplasmaDB y PlasmoDB. El panel derecho muestra diagramas esquemáticos de BgAP2-M y proteínas relacionadas en otros parásitos apicomplejos. Los dominios conservados, incluidos los dominios AP2 (naranja) y los dominios ACDC (azul), están resaltados por diferentes rectángulos, así como las señales de localización nuclear (NLS)

Además, el dominio AP2 de BgAP2-M estaba bien conservado entre otros parásitos apicomplejos, como se muestra en la Fig. 8A. Las extraordinarias similitudes de secuencia sugirieron la presencia de motivos de ADN idénticos en el genoma. Anteriormente se descubrió que TA13515 (ortólogo de PF3D7_1222600 PfAP2-G) se une a motivos GxGTACxC idénticos [42]. La región altamente similar tiene una estructura secundaria clásica, tres hebras y una hélice, lo que indica una forma análoga de unirse al ADN. Mediante el modelado de homología de estructuras terciarias utilizando PF3D7_1466400 como plantilla [43], se predijeron las estructuras canónicas de tres hebras y una hélice, como se muestra en la Fig. 8B.

Múltiples alineamientos y predicción de la estructura terciaria del dominio conservado AP2 en BgAP2-M. Se compararon los dominios AP2 de BgAP2-M y ortólogos similares de otros parásitos apicomplejos con los números de acceso marcados a la izquierda del diagrama. Las estructuras secundarias predichas se resaltaron con flechas de diferentes colores, hebras β (amarillas) y hélice α (azul). B La predicción de la estructura terciaria del dominio BgAP2-M AP2. Panel izquierdo: estructura terciaria predicha del dominio AP2 de BgAP2-M (generada usando SWISS-MODEL). Panel derecho: la estructura terciaria publicada del dominio AP2 de PF3D7_1466400. Se representaron las hebras β (amarillas) y la hélice α (azul).

Se utilizaron anticuerpos policlonales preparados contra los péptidos BgAP2-M para identificar la expresión de la proteína BgAP2-M nativa en B. gibsoni (aislado de Wuhan). Se detectó una banda específica de aproximadamente 73 kDa en el lisado de B. gibsoni cultivada in vitro o in vivo (aislado de Wuhan), de acuerdo con el peso molecular previsto de la proteína madura (Fig. 9). Por el contrario, no se detectaron productos en el grupo de control negativo. La detección de la proteína histona H3 demostró una carga de proteína igual en diferentes carriles.

Inmunotransferencia de la proteína BgAP2-M nativa de B. gibsoni cultivada in vitro o in vivo (aislado de Wuhan). Carril M: marcador de peso molecular; Carril 1: lisado de B. gibsoni cultivada in vitro sondada con anticuerpos policlonales de conejo contra péptidos BgAP2-M; Carril 2: lisado de B. gibsoni in vivo sondado con anticuerpos policlonales de conejo contra péptidos BgAP2-M; Carril 3: lisado de eritrocitos de Canis no infectados sondados con anticuerpos policlonales de conejo contra péptidos BgAP2-M; Carril 4: lisado de B. gibsoni cultivada in vitro sondada con suero de conejo preinmune; Carril 5: lisado de B. gibsoni in vivo sondado con suero de conejo preinmune; Carril 6: lisado de eritrocitos de Canis no infectados sondados con suero de conejo preinmune. Las flechas indican las bandas correspondientes. Se utilizó anticuerpo anti-histona H3 como control de carga para detectar la expresión de BgAP2-M.

La localización de BgAP2-M se determinó mediante IFA utilizando anticuerpos policlonales contra péptidos de BgAP2-M. El IFA mostró una fuerte reactividad con el antisuero tanto en los parásitos intra como extraeritrocíticos de B. gibsoni (Fig. 10). Como se esperaba, BgAP2-M se localizó en los núcleos de B. gibsoni. Sin embargo, no se observó ninguna señal de fluorescencia en el grupo de control negativo. El citosol de B. gibsoni se tiñó con anticuerpos contra GAPDH.

Ensayos de inmunofluorescencia indirecta que detectan la ubicación de la proteína BgAP2-M nativa en B. gibsoni (aislado de Wuhan). La proteína BgAP2-M y los núcleos del parásito se tiñeron con anticuerpos policlonales contra los péptidos BgAP2-M (rojo) y Hoechst 33,342 (azul), respectivamente. Se utilizó anticuerpo anti-GAPDH para teñir el citosol de los parásitos (verde). a Merozoítos extracelulares. b Etapa de anillo. c Etapa de diada. d Etapa tétrada. e Control negativo: el anticuerpo primario era suero de conejo preinmune. Barra de escala = 5 μm

En este estudio, basado en el establecimiento exitoso de un sistema de cultivo in vitro de B. gibsoni (aislado de Wuhan), se observaron e identificaron los cambios en la morfología y la infectividad de B. gibsoni (aislado de Wuhan) después de un cultivo in vitro a largo plazo. La secuenciación del transcriptoma se realizó utilizando B. gibsoni (aislado de Wuhan) cultivado in vivo e in vitro en la etapa sanguínea. Se identificaron algunos DEG relacionados con el crecimiento, la invasión y la virulencia de los parásitos, y se identificó una familia de factores de transcripción ApiAP2, incluido un nuevo factor de transcripción AP2 (BgAP2-M), que puede estar involucrado en la merogonía de los parásitos en la etapa asexual. . La proteína BgAP2-M nativa tenía un peso molecular de aproximadamente 73 kDa, consistente con el tamaño previsto. Además, la proteína BgAP2-M se localizó en el núcleo de B. gibsoni, incluidas las etapas intra y extraeritrocíticas, que compartían un fenómeno común con otros factores de transcripción AP2 identificados en Plasmodium spp. y Toxoplasma spp.

Se han establecido sistemas de cultivo in vitro de varias especies de Babesia, incluidas B. bovis, B. bigemina, B. gibsoni, B. duncani y B. orientalis, entre otras [11,12,13, 44, 45], lo que proporciona una plataforma conveniente para la manipulación genética y la investigación sobre la interacción entre parásitos y huéspedes. Sin embargo, durante el cultivo in vitro continuo, la morfología y la infectividad de los parásitos parecen sufrir cambios considerables, quizás debido a diferencias en los niveles de nutrientes o factores físicos ambientales [21]. Por ejemplo, en un estudio anterior, el aislado de B. gibsoni Oita se cultivó con éxito in vitro durante 738 días en el subcultivo 214; sin embargo, el tamaño de los parásitos aumentó y se observaron múltiples formas de parásitos, como parásitos grandes con forma ovalada o petaloide. Al mismo tiempo, la infectividad y virulencia de los parásitos disminuyeron considerablemente en los huéspedes naturales [13, 16]. De manera similar, B. gibsoni (aislado de Wuhan) experimentó mayores cambios morfológicos de pequeños parásitos en forma de anillo a grandes parásitos en forma de anillo, parásitos en forma de díada, parásitos en forma de tétrada, parásitos octoploides y esquizontes. Además, se observó que la infectividad en perros era menor.

Para investigar más a fondo la variación transcripcional en genes basada en estos cambios en la morfología y la infectividad de los parásitos después de la adaptación in vitro, se llevó a cabo la secuenciación del transcriptoma en B. gibsoni en etapa sanguínea (aislado de Wuhan) de grupos cultivados in vivo e in vitro. En particular, algunos genes implicados en el proceso de invasión del parásito demostraron una mayor expresión después de la adaptación in vitro, como la proteína 2 de la superficie del merozoito y la proteína 14 del micronema; Es de suponer que esto se debió a una mayor propagación asexual y una alta parasitemia en el entorno in vitro, que estaba libre de la presión del sistema inmunológico del huésped. De manera similar, en P. falciparum, también se demostró que la proteína micronema apicomplexa similar a claudina (CLAMP) como factor de invasión tiene un nivel de transcripción más alto en las cepas adaptadas in vitro a largo plazo que en los aislados clínicos in vivo [19]. Además, el nivel de transcripción de la proteína 3 del cuerpo esférico en B. gibsoni (aislado de Wuhan) también aumentó notablemente. Los primeros estudios sobre B. bovis determinaron que la proteína 2 del cuerpo esférico, copia truncada 11 (sbp2t11), desempeña un papel importante como marcador de atenuación al comparar cuatro cepas atenuadas distintas con sus correspondientes cepas virulentas [33].

Sin embargo, SBP3 de B. gibsoni (aislado de Wuhan) compartía poca similitud con sbp2t11 de B. bovis, aunque ambos pertenecen a la familia de proteínas del cuerpo esférico. Por lo tanto, es necesario confirmar experimentalmente si la regulación positiva del gen SBP3 representa la menor virulencia de B. gibsoni (aislado de Wuhan). Para Plasmodium spp. y Babesia spp., cepas adaptadas in vitro en laboratorio, suelen carecer de acceso a vectores de transmisión (mosquitos o garrapatas); así, experimentan una etapa eritrocítica más asexual, así como una etapa menos sexual. En consecuencia, los genes que codifican antígenos de la etapa sexual estaban regulados negativamente en los parásitos cultivados in vitro en comparación con los aislados in vivo. Por ejemplo, los genes relacionados con la etapa sexual (antígeno gameto 27/25) y el gen del factor de transcripción AP2 (AP2-G), que es esencial regular a la baja en cepas adaptadas en laboratorio de P. falciparum y P. knowlesi, que fueron esencial para el compromiso y el desarrollo de la etapa sexual [17]. En cuanto a B. gibsoni (aislado de Wuhan), no fue una excepción que se encontró que proteínas similares de la etapa sexual (hap2 y AP2-G) estaban reguladas negativamente para prevenir la gametocitogénesis.

Curiosamente, varios factores de transcripción AP2 estaban regulados hacia arriba o hacia abajo, y se ha observado un fenómeno similar en otras especies de Plasmodium. En 2005, se describió por primera vez que la familia de factores de transcripción ApiAP2 (apicoplexan AP2) contenía dominios conservados similares al dominio de unión al ADN de Apetala2/factor de respuesta de etileno (AP2/ERF) en plantas [22, 46], y hasta ahora está bien identificada. en Plasmodium spp. o Toxoplasma spp. Estudios previos sobre la adaptación del cultivo de P. falciparum en el laboratorio han revelado cambios transcripcionales en múltiples genes del factor de transcripción AP2, incluidos los genes ApiAP2 (PF3D7_1222600, PF3D7_1222400 y PF3D7_1342900), que revelaron tener mutaciones de pérdida de función con codones de parada prematuros. 18]. Estas mutaciones adaptativas sin sentido probablemente podrían producir proporcionalmente más etapas asexuales para la supervivencia y la propagación, junto con una resistencia progresiva a las frecuentes fluctuaciones de temperatura durante el cultivo in vitro. Mostramos cambios transcripcionales en todos los miembros del factor de transcripción AP2 de B. gibsoni (aislado de Wuhan) mediante ensayos qRT-PCR. En particular, dos genes del factor de transcripción AP2 (BgWH_04g01044, homólogo de BBOV_III009600, y BgWH_04g00976, homólogo de BBOV_III008870) se regularon negativamente durante la adaptación in vitro. Se planteó la hipótesis de que estos dos factores de transcripción podrían regular el desarrollo de la etapa sexual. Por lo tanto, se necesitan con urgencia ensayos de secuenciación de alteración genética y inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en estudios futuros. Más sorprendente fue la prominente regulación positiva de cinco genes del factor de transcripción AP2, dos de los cuales son homólogos de PfAP2-O y PfSIP2. Los ensayos de ChIP de todo el genoma describieron una unión de alta afinidad con promotores de familias de genes de virulencia subtelomérica para PfAP2-O y PfSIP2, lo que influye significativamente en el crecimiento del parásito en etapa asexual [37, 39]. La regulación positiva de los homólogos de PfAP2-O y PfSIP2 en B. gibsoni (aislado de Wuhan) probablemente se asoció con un aumento de los ciclos de la etapa asexual y la propagación causada por la adaptación del cultivo. Curiosamente, un factor de transcripción AP2 de B. gibsoni (aislado de Wuhan) (un homólogo de PF3D7_1239200 o BBOV_IV011830) se reguló positivamente después del cultivo in vitro, lo que indica su papel considerable en la regulación de la transcripción de genes relacionados con la merogonía durante la etapa asexual. Identificamos un nuevo factor de transcripción AP2, BgAP2-M. Se reveló que BgAP2-M tenía solo un dominio AP2 a través de múltiples alineamientos, lo que mostró una alta similitud de secuencia aa con otras especies de apicomplejos.

Además, se predijo una estructura secundaria canónica de tres cadenas y una hélice, lo que sugiere un reclutamiento más estable aguas arriba de los genes diana. Además, se detectó un nuevo ACDC (dominio coincidente con AP2, principalmente en el extremo C (ACDC), que está bien conservado en los parásitos apicomplejos. En particular, este dominio desconocido se encuentra exclusivamente en el extremo C de los factores de transcripción AP2. Por lo tanto, , la coexistencia de estos dos dominios puede implicar funciones potenciales en la transcripción genética, la modificación de la cromatina y la remodelación.35 Para caracterizar aún más la proteína BgAP2-M nativa, se prepararon anticuerpos policlonales contra los péptidos BgAP2-M. BgAP2-M fue ~ 73 kDa en el lisado de B. gibsoni cultivado in vitro o in vivo (aislado de Wuhan), según lo determinado por transferencia Western, lo que fue consistente con la predicción teórica. IFA reveló la localización de los núcleos de B. gibsoni Se observaron intensas señales de fluorescencia en merozoitos extracelulares salientes o en parásitos intracelulares de las etapas de forma de anillo, díada y tétrada, lo que implica un posible papel de BgAP2-M en el desarrollo de la merogonía. Los estudios futuros deberían centrarse en experimentos funcionales, como construir mutantes de alteración genética o realizar ensayos ChIP-seq. Sin embargo, los homólogos de BgAP2-M en otras especies de Plasmodium (P. falciparum, P. berghei y P. yoelii) no lograron ser alterados directamente en la etapa sanguínea después de varios intentos, lo que indica su papel extremadamente importante en el desarrollo del parásito [47 ,48,49].

La secuenciación del transcriptoma se realizó por primera vez en cultivos in vivo e in vitro de B. gibsoni (aislado de Wuhan) en función de cambios en la morfología y la infectividad. A partir de esto, se descubrieron una serie de DEG, lo que permitió una comprensión más sofisticada de las vías relacionadas con la invasión, la virulencia y el crecimiento en las etapas asexual y sexual de los parásitos. Un análisis adicional de qRT-PCR de la familia del factor de transcripción AP2 de B. gibsoni (aislado de Wuhan) identificó un nuevo factor de transcripción AP2 (BgAP2-M) con un tamaño de ~ 73 kDa. Se localizó en los núcleos de B. gibsoni desde las etapas extracelular e intracelular. El presente estudio explica detalladamente los cambios transcripcionales en B. gibsoni (aislado de Wuhan) después de un cultivo in vitro continuo. Informa sobre un nuevo factor de transcripción AP2 (BgAP2-M) que puede regular la merogonía de los parásitos durante la etapa asexual de desarrollo. Sin embargo, los genes diana específicos regulados por BgAP2-M en la etapa asexual siguen siendo desconocidos y se justifica realizar más investigaciones.

Todos los datos de RNA-Seq utilizados en este estudio se han depositado en la base de datos NCBI SRA (números de acceso: SRR24288283, SRR24288284, SRR24288285, SRR24288286, SRR24288287 y SRR24288288).

ADN genómico

ADN complementario

PCR cuantitativa en tiempo real

Modelo de ecuación estructural recursivo.

Herramienta básica de búsqueda de alineación local

Hemocianina de lapa californiana

Electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida

Solución salina tamponada con Tris con Tween 20

Solución salina tamponada con fosfato

Peroxidasa de rábano picante

Señal de localización nuclear

Albúmina de suero bovino

Goethert HK, Molloy P, Berardi V, Weeks K, Telford SR 3. Babesia microti zoonótica en el noreste de EE. UU.: evidencia de la expansión de un linaje de parásito específico. Más uno. 2018;13:e0193837. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193837.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Margalit Levi M, Nachum-Biala Y, King R, Baneth G. Un estudio de Babesia spp. y Hepatozoon spp. en cánidos salvajes en Israel. Vectores parásitos. 2018;11:150. https://doi.org/10.1186/s13071-018-2715-x.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

He L, Liu Q, Yao B, Zhou Y, Hu M, Fang R, et al. Una descripción histórica de la investigación sobre Babesia orientalis, un parásito protozoario que infecta al búfalo de agua. Microbiol frontal. 2017;8:1323. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01323.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Singh MN, Raina OK, Sankar M, Rialch A, Tigga MN, Kumar GR, et al. Detección molecular y diversidad genética de Babesia gibsoni en perros en la India. Infectar Genet Evol. 2016;41:100–6. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2016.03.025.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kjemtrup AM, Kocan AA, Whitworth L, Meinkoth J, Birkenheuer AJ, Cummings J, et al. Hay al menos tres pequeños piroplasmas genéticamente distintos de los perros. Int J Parasitol. 2000;30:1501–5. https://doi.org/10.1016/s0020-7519(00)00120-x.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Irwin PJ. Babesiosis canina. Vet Clin N Am Small Anim Pract. 2010;40:1141–56. https://doi.org/10.1016/j.cvsm.2010.08.001.

Artículo de Google Scholar

Higuchi S, Simomura S, Yoshida H, Hoshi F, Kawamura S, Yasuda Y. Desarrollo de Babesia gibsoni en la hemolinfa de la garrapata vectora, Haemaphysalis longicornis. J Vet Med Sci. 1991;53:491–3. https://doi.org/10.1292/jvms.53.491.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Higuchi S, Oya H, Hoshi F, Kawamura S, Yasuda Y. Observaciones de Babesia gibsoni en células epiteliales del intestino medio de la garrapata Haemaphysalis longicornis. Tercer Arco Exp Med. 1992;65:143–7.

CAS PubMed Google Académico

Higuchi S, Konno H, Hoshi F, Kawamura S, Yasuda Y. Observaciones de Babesia gibsoni en el ovario de la garrapata Haemaphysalis longicornis. Tercer Arco Exp Med. 1993;65:153–8.

PubMed Google Académico

Higuchi S, Hoshina H, Hoshi F, Kawamura S, Yasuda Y. Desarrollo de Babesia gibsoni en las glándulas salivales de la garrapata Haemaphysalis longicornis. Arco Kitasato Exp Med. 1993;65:147–51.

PubMed Google Académico

Levy MG, Ristic M. Babesia bovis: cultivo continuo en un cultivo en fase estacionaria microaerófila. Ciencia. 1980;207:1218–20. https://doi.org/10.1126/science.7355284.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Vega CA, Buening GM, Green TJ, Carson CA. Cultivo in vitro de Babesia bigemina. Soy J Vet Res. 1985;46:416–20.

CAS PubMed Google Académico

Sunaga F, Namikawa K, Kanno Y. Cultivo continuo in vitro de estadios eritrocíticos de Babesia gibsoni y virulencia del parásito cultivado. J Vet Med Sci. 2002;64:571–5. https://doi.org/10.1292/jvms.64.571.

Artículo PubMed Google Scholar

Lim C, Hansen E, Desimone TM, Moreno Y, Junker K, Bei A, et al. La expansión del nicho celular del huésped puede impulsar la adaptación de un parásito zoonótico de la malaria a los humanos. Comuna Nacional. 2013;4:1638. https://doi.org/10.1038/ncomms2612.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Moon RW, Hall J, Rangkuti F, Ho YS, Almond N, Mitchell GH, et al. Adaptación del patógeno de la malaria genéticamente tratable Plasmodium knowlesi al cultivo continuo en eritrocitos humanos. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2013;110:531–6. https://doi.org/10.1073/pnas.1216457110.

Artículo PubMed Google Scholar

Sunaga F, Taharaguchi S, Arai S, Itoh S, Kanno Y. Atenuación de la virulencia de Babesia gibsoni mediante pases seriados in vitro y evaluación de la protección proporcionada por la inmunización contra el aislado pasado en perros. Parasitol veterinario. 2013;197:565–70. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2013.05.015.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mackinnon MJ, Li J, Mok S, Kortok MM, Marsh K, Preiser PR, et al. Análisis transcripcional y genómico comparativo de aislados de campo de Plasmodium falciparum. PLOS Patog. 2009;5:e1000644. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000644.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Claessens A, Affara M, Assefa SA, Kwiatkowski DP, Conway DJ. La adaptación cultural de los parásitos de la malaria selecciona mutantes convergentes con pérdida de función. Representante de ciencia 2017;7:41303. https://doi.org/10.1038/srep41303.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tarr SJ, Díaz-Ingelmo O, Stewart LB, Hocking SE, Murray L, Duffy CW, et al. Variación del transcriptoma de esquizontes entre aislados clínicos y clones adaptados en laboratorio del parásito de la malaria Plasmodium falciparum. Genómica BMC. 2018;19:894. https://doi.org/10.1186/s12864-018-5257-x.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moon RW, Sharaf H, Hastings CH, Ho YS, Nair MB, Rchiad Z, et al. Proteína de unión a normocitos necesaria para la invasión de eritrocitos humanos por el parásito zoonótico de la malaria Plasmodium knowlesi. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2016;113:7231–6. https://doi.org/10.1073/pnas.1522469113.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brown AC, Guler JL. De la circulación al cultivo: Plasmodium in vivo versus in vitro. Tendencias Parasitol. 2020;36:914–26. https://doi.org/10.1016/j.pt.2020.08.008.

Artículo PubMed Google Scholar

Balaji S, Babu MM, Iyer LM, Aravind L. Descubrimiento de los principales factores de transcripción específicos de Apicomplexa y su implicación para la evolución de los dominios de unión al ADN de la integrasa AP2. Ácidos nucleicos res. 2005;33:3994–4006. https://doi.org/10.1093/nar/gki709.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamasaki K, Kigawa T, Seki M, Shinozaki K, Yokoyama S. Dominios de unión al ADN de factores de transcripción específicos de plantas: estructura, función y evolución. Tendencias de ciencia vegetal. 2013;18:267–76. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2012.09.001.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Grabherr MG, Haas BJ, Yassour M, Levin JZ, Thompson DA, Amit I, et al. Ensamblaje del transcriptoma de longitud completa a partir de datos de RNA-Seq sin un genoma de referencia. Nat Biotecnología. 2011;29:644–52. https://doi.org/10.1038/nbt.1883.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li B, Dewey CN. RSEM: cuantificación precisa de la transcripción a partir de datos de RNA-Seq con o sin un genoma de referencia. Bioinformación de BMC. 2011;12:323. https://doi.org/10.1186/1471-2105-12-323.

Artículo CAS Google Scholar

Reiner A, Yekutieli D, Benjamini Y. Identificación de genes expresados diferencialmente mediante procedimientos de control de la tasa de descubrimiento falso. Bioinformática. 2003;19:368–75. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btf877.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Livak KJ, Schmittgen TD. Análisis de datos de expresión genética relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real y el método 2 (-Delta Delta C (T)). Métodos. 2001;25:402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART 7: actualizaciones recientes del recurso de anotación de dominios de proteínas. Ácidos nucleicos res. 2012;40:D302–5. https://doi.org/10.1093/nar/gkr931.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nguyen Ba AN, Pogoutse A, Provart N, Moses AM. NLStradamus: un modelo oculto de Markov simple para la predicción de señales de localización nuclear. Bioinformación de BMC. 2009;10:202. https://doi.org/10.1186/1471-2105-10-202.

Artículo CAS Google Scholar

Aiyar A. El uso de Clustal W y Clustal X para el alineamiento de secuencias múltiples. Métodos Mol Biol. 2000;132:221–41. https://doi.org/10.1385/1-59259-192-2:221.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kumar S, Stecher G, Mega TK. Análisis de genética evolutiva molecular versión 7.0 para conjuntos de datos más grandes. Mol Biol Evol. 2016;33:1870–4.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waterhouse A, Bertoni M, Bienert S, Studer G, Tauriello G, Gumienny R, et al. SWISS-MODEL: modelado por homología de estructuras y complejos proteicos. Ácidos nucleicos res. 2018;46:W296–303. https://doi.org/10.1093/nar/gky427.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

[ PubMed ] Gallego-López GM, Lau AOT, Brown WC, Johnson WC, Ueti MW, Suárez CE. La proteína corporal esférica 2 truncó la copia 11 como marcador de atenuación específico de Babesia bovis. Vectores de parásitos. 2018;11:1 https://doi.org/10.1186/s13071-018-2782-z.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Santos JM, Josling G, Ross P, Joshi P, Orchard L, Campbell T, et al. La invasión de los glóbulos rojos por parte del parásito de la malaria está coordinada por el factor de transcripción PfAP2-I. Microbio huésped celular. 2017;21:e10.

Artículo de Google Scholar

Oehring SC, Woodcroft BJ, Moes S, Wetzel J, Dietz O, Pulfer A, et al. La proteómica organelar revela cientos de nuevas proteínas nucleares en el parásito de la malaria Plasmodium falciparum. Genoma Biol. 2012;13:R108. https://doi.org/10.1186/gb-2012-13-11-r108.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Josling GA, Russell TJ, Venezia J, Orchard L, van Biljon R, Painter HJ, et al. Diseccionando el papel de PfAP2-G en la gametocitogénesis de la malaria. Comuna Nacional. 2020;11:1503. https://doi.org/10.1038/s41467-020-15026-0.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Flueck C, Bartfai R, Niederwieser I, Witmer K, Alako BT, Moes S, et al. Un papel importante de la proteína PfSIP2 de Plasmodium falciparum ApiAP2 en la biología del extremo de los cromosomas. PLOS Patog. 2010;6:e1000784. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000784.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yuda M, Iwanaga S, Shigenobu S, Mair GR, Janse CJ, Waters AP, et al. Identificación de un factor de transcripción en la etapa invasiva de mosquitos de los parásitos de la malaria. Mol Microbiol. 2009;71:1402–14. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2009.06609.x.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cubillos EFG, Prata IO, Fotoran WL, Ranford-Cartwright L, Wunderlich G. El factor de transcripción PfAP2-O influye en la transcripción del gen de virulencia y el desarrollo sexual en Plasmodium falciparum. Microbiol de infección de células frontales. 2021;11:669088. https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.669088.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaneko I, Iwanaga S, Kato T, Kobayashi I, Yuda M. Identificación de todo el genoma de los genes diana de AP2-O, un factor de transcripción de la familia Plasmodium AP2. PLOS Patog. 2015;11:e1004905. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004905.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walker R, Gissot M, Huot L, Alayi TD, Hot D, Marot G, et al. El factor de transcripción de toxoplasma TgAP2XI-5 regula la expresión de genes implicados en la virulencia del parásito y la invasión del huésped. J Biol Chem. 2013;288:31127–38. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.486589.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pieszko M, Weir W, Goodhead I, Kinnaird J, Shiels B. Factores ApiAP2 como reguladores candidatos del compromiso estocástico con la producción de merozoitos en Theileria annulata. PLOS Negl Trop Dis. 2015;9:e0003933. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003933.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De Silva EK, Gehrke AR, Olszewski K, León I, Chahal JS, Bulyk ML, et al. Unión específica al ADN mediante factores de transcripción AP2 de apicomplejo. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2008;105:8393–8. https://doi.org/10.1073/pnas.0801993105.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Abraham A, Brasov I, Thekkiniath J, Kilian N, Lawres L, Gao R, et al. El establecimiento de un cultivo in vitro continuo de Babesia duncani en eritrocitos humanos revela una tolerancia inusualmente alta a las terapias recomendadas. J Biol Chem. 2018;293:19974–81. https://doi.org/10.1074/jbc.AC118.005771.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Singh P, Pal AC, Mamoun CB. Un medio de cultivo alternativo para la propagación continua in vitro del patógeno humano Babesia duncani en eritrocitos humanos. Patógenos. 2022;11:5. https://doi.org/10.3390/pathogens11050599.

Artículo CAS Google Scholar

Riechmann JL, Meyerowitz EM. La familia AP2/EREBP de factores de transcripción vegetales. Bioquímica. 1998;379:633–46. https://doi.org/10.1515/bchm.1998.379.6.633.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Modrzynska K, Pfander C, Chappell L, Yu L, Suárez C, Dundas K, et al. Una prueba de eliminación de genes ApiAP2 revela redes de reguladores transcripcionales que interactúan y controlan el ciclo de vida del plasmodio. Microbio huésped celular. 2017;21:11–22. https://doi.org/10.1016/j.chom.2016.12.003.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang C, Li Z, Cui H, Jiang Y, Yang Z, Wang X, et al. Las modificaciones sistemáticas mediadas por CRISPR-Cas9 de los genes Plasmodium yoelii ApiAP2 revelan conocimientos funcionales sobre el desarrollo del parásito. MBio. 2017;8:6. https://doi.org/10.1128/mBio.01986-17.

Artículo de Google Scholar

Shang X, Wang C, Fan Y, Guo G, Wang F, Zhao Y, et al. El panorama de todo el genoma de los factores de transcripción ApiAP2 revela una red reguladora asociada a la heterocromatina durante el desarrollo de la etapa sanguínea de Plasmodium falciparum. Ácidos nucleicos res. 2022;50:3413–31. https://doi.org/10.1093/nar/gkac176.

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No aplica.

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones Nos. 32273030 y 31772729) y Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales de China (Proyecto 2662020DKPY016).

Laboratorio Estatal Clave de Microbiología Agrícola, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, 430070, Hubei, China

Zhen Han, Yaxin Zheng, Yu Shi, Fangwei Chen, Chenglong Wu, Lingna Wang, Shiyu Lu, Dongfang Li, Xingai Guan, Lan He y Junlong Zhao

Laboratorio clave de medicina veterinaria preventiva en la provincia de Hubei, Centro de innovación cooperativa para la producción porcina sostenible, Wuhan, 430070, Hubei, China

Zhen Han, Yaxin Zheng, Yu Shi, Fangwei Chen, Chenglong Wu, Lingna Wang, Shiyu Lu, Dongfang Li, Xingai Guan, Lan He y Junlong Zhao

Laboratorio clave de desarrollo de productos de diagnóstico veterinario, Ministerio de Agricultura de la República Popular China, Wuhan, 430070, Hubei, China

Lan He y Junlong Zhao

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ZH, LH y JZ diseñaron el estudio y redactaron el manuscrito. ZH, YZ, ZN y HZ realizaron los experimentos. YZ y XS participaron en el análisis de datos. Todos los autores han leído y aprobado la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Junlong Zhao.

Los animales de experimentación fueron alojados y tratados siguiendo las normas estipuladas para la regulación de la administración de asuntos en los animales de experimentación de la República Popular China. Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Provincia de Hubei y el Comité de Ética de la Universidad Agrícola de Huazhong (número de permiso: HZAUMO-2019-016).

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Términos GO y anotaciones de la ruta KEGG de DEG en este estudio.

Cebadores qRT-PCR utilizados para validar los datos de secuenciación de ARN.

Cebadores qRT-PCR para los genes de la familia ApiAP2 de B. gibsoni.

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Reimpresiones y permisos

Han, Z., Zheng, Y., Shi, Y. et al. Variación transcripcional en Babesia gibsoni (aislado de Wuhan) entre cultivos in vivo e in vitro en etapa sanguínea. Vectores de parásitos 16, 268 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05869-z

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Recibido: 09 de mayo de 2023

Aceptado: 04 de julio de 2023

Publicado: 07 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05869-z

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