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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11652 (2023) Citar este artículo

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La edición del genoma CRISPR es una herramienta poderosa para dilucidar funciones biológicas. Para modificar el genoma según lo previsto, es fundamental comprender los distintos modos de recombinación que pueden ocurrir. En este estudio, informamos inserciones de vectores complejos que se identificaron durante la generación de alelos condicionales mediante edición CRISPR utilizando unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ). El vector de direccionamiento contenía dos secuencias loxP y microhomologías de 40 pb flanqueantes. Las regiones genómicas correspondientes a las secuencias loxP se escindieron con Cas9 en células madre embrionarias de ratón. La detección por PCR para recombinación dirigida reveló una alta frecuencia de bandas de mayor tamaño de lo esperado. La secuenciación de nanoporos de estas bandas reveló inserciones de vectores complejas mediadas no solo por MMEJ sino también por unión de extremos no homólogos y recombinación homóloga en al menos el 17% de los clones. Una nueva banda apareció al mejorar las condiciones de la PCR, lo que sugiere la presencia de alelos modificados involuntariamente que escapan al análisis de PCR estándar. Esto nos llevó a caracterizar la recombinación de cada alelo de los clones editados con genoma utilizando polimorfismos heterocigotos de un solo nucleótido, lo que llevó a la confirmación de la presencia de alelos homocigotos. Nuestro estudio indica que es necesario un control de calidad cuidadoso de los clones editados con genoma para excluir la inserción de vectores complejos, no intencionados y en el objetivo.

En los últimos años, la tecnología de modificación del genoma ha progresado mucho con la llegada del sistema CRISPR1. Sin embargo, siempre es posible que se produzca una recombinación no deseada en la edición del genoma CRISPR. Por lo tanto, el control de calidad de los clones editados con genoma es importante para garantizar que la recombinación prevista en los clones no vaya acompañada de una recombinación no deseada. Puede ocurrir una recombinación no deseada en el sitio objetivo de recombinación o en regiones genómicas distantes del sitio objetivo. El último tipo de recombinación ocurre a menudo en secuencias genómicas similares a la secuencia objetivo debido al recocido parcial de los ARN guía (ARNg). Esta recombinación se denomina efectos “fuera del objetivo” y se han desarrollado varios métodos para detectarla2,3. Con respecto a la anterior recombinación no intencionada “en el objetivo”, se han informado grandes eliminaciones en el sitio objetivo4,5,6,7. Normalmente, los recombinantes de interés se seleccionan mediante PCR. Por lo tanto, las grandes eliminaciones genómicas que acompañan a la pérdida de los sitios de unión del cebador de la PCR pueden pasar desapercibidas. Recientemente, se han informado otros tipos de recombinación no deseada en el objetivo en los que se insertan vectores de ARNg o ADN mitocondrial en el sitio de escisión genómica objetivo8. Aunque los sitios de unión del cebador de la PCR se conservaron en estos casos, la inserción de la secuencia exógena no deseada pasó desapercibida en la detección inicial de la PCR porque el tamaño del amplicón de la PCR estaba por encima del límite de detección. Esta recombinación involuntaria en el objetivo debe examinarse cuidadosamente, especialmente cuando se pretende editar el genoma bialélico, ya que la pérdida del alelo de tipo salvaje (wt), verificada mediante análisis de PCR, puede deberse no a la edición del genoma homocigótico sino a la combinación de recombinación en un alelo y recombinación no deseada en el otro alelo.

En el presente estudio, informamos sobre patrones de inserción de vectores en el objetivo, complejos, no deseados, que identificamos en el proceso de generación de alelos condicionales para el sistema Cre/loxP en células cultivadas. Para generar un alelo condicional, se deben insertar dos secuencias loxP, una aguas arriba y otra aguas abajo de la región genómica objetivo. Además, para realizar análisis fenotípicos en células cultivadas, ambos alelos deben modificarse de la misma forma. Por tanto, es necesario insertar un total de cuatro sitios loxP en el genoma. Se pueden emplear diferentes vías de reparación, es decir, recombinación homóloga (HR), unión de extremos no homólogos (NHEJ) y unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ), para introducir secuencias extrañas en el genoma. La HR es la vía más utilizada y requiere un brazo de homología de 500 a 1000 pb en el vector objetivo9. Se informa que la vía HR está activa principalmente desde la última fase S hasta la fase G2 del ciclo celular10. Por el contrario, la vía NHEJ está activa durante todo el ciclo celular10. Por lo tanto, el método basado en NHEJ permite la inserción dirigida en tipos de células en los que el método HR es ineficaz, como las neuronas, aunque la secuencia de unión en el sitio de recombinación es difícil de controlar en comparación con la de HR11. Más recientemente, se desarrolló un método llamado sistema PITCh (Precise Integration into Target Chromosome) que utiliza MMEJ12,13. Este método utiliza brazos de microhomología de tan solo 10 a 40 bases de longitud para la recombinación. Se informa que la vía MMEJ está activa principalmente desde la fase M hasta la fase S temprana14, lo que permite un modo de recombinación diferente en comparación con la HR. Empleamos el método PITCh en el presente estudio porque la inserción de la secuencia loxP de 34 bases en el genoma puede detectarse fácilmente mediante PCR debido a la corta longitud del brazo de homología del vector de direccionamiento. Sin embargo, la detección por PCR reveló bandas de tamaños no deseados que eran más largas de lo esperado con una alta frecuencia. El análisis de estas bandas con secuenciación de lectura larga de Nanopore reveló inserciones de vectores complejas que involucran no solo a MMEJ sino también a HR y NHEJ. El tamaño de la secuencia del vector insertada podría estar más allá del límite de detección del método de control de calidad estándar basado en PCR para clones editados con genoma. Proponemos que la recombinación no deseada en el objetivo detectada en este estudio debe excluirse cuidadosamente en la etapa de control de calidad de la edición del genoma.

La Figura 1A presenta una descripción general del sistema de edición del genoma mediado por MMEJ PITCh12,13. La secuencia completa del vector de direccionamiento se muestra en la figura complementaria 1. El método PITCh se puede clasificar en tres tipos según el número de sitios de corte en el genoma y el vector de direccionamiento. Cortar el genoma y el vector de direccionamiento en un sitio es sencillo, pero la columna vertebral del plásmido del vector de direccionamiento se incorpora al genoma (Fig. 1A, izquierda). Cortar en un sitio del genoma y dos sitios en el vector de direccionamiento evita la incorporación de la columna vertebral del plásmido al genoma (Fig. 1A, centro). En el presente estudio, cortamos en dos sitios tanto en el genoma como en el vector de direccionamiento (Fig. 1A, derecha). Esta estrategia permite la inserción de secuencias exógenas en cada sitio de corte del genoma.

Descripción general de la estrategia de focalización mediada por MMEJ. (A) El sistema de edición del genoma mediado por MMEJ PITCh, clasificado por el número de sitios de corte en el genoma y el vector objetivo. Líneas gruesas rojas y azules, microhomologías; cuadro amarillo, secuencia exógena. (B) Generación del alelo condicional en el locus Klf2 del ratón. Exón E, microhomología 5′mH 5′, microhomología 3′mH 3′, promotor PGK fosfoglicerato quinasa-1, gen de resistencia a neo neomicina, señal de poliadenilación pA. (C) Alelo eliminado generado cuando el vector de direccionamiento no participó en la recombinación. El tamaño de cada elemento no es a escala exacta debido a limitaciones de espacio.

La Figura 1B ilustra la estrategia empleada en la creación del alelo condicional para el sistema Cre/loxP utilizando el método PITCh. Planeamos eliminar el exón 2 del gen Klf2 de ratón utilizando el sistema Cre/loxP en células madre embrionarias de ratón (ESC). Expresamos los ARNg como ARN de guía única (ARNg) utilizando el vector de expresión Cas9/ARNg pX33015. Los sitios LoxP se insertaron en el vector de direccionamiento exactamente en los sitios de corte del complejo Cas9/gRNA. Se colocaron cuarenta pares de bases de microhomologías aguas arriba y aguas abajo de los sitios loxP en el vector de direccionamiento. El sitio objetivo del ARNg, que se describe en el informe original sobre el sistema PITCh12, se insertó fuera de las microhomologías del vector de direccionamiento (Figura 1 complementaria). El vector de direccionamiento contenía el casete del gen de resistencia a la neomicina (neo) para enriquecer los eventos objetivo mediante la selección de G418.

Se transfectaron ESC de ratón con el vector de direccionamiento y los tres ARNg (Fig. 1B). La escisión exitosa de los sitios objetivo del ARNg expondría microhomologías en el genoma y el vector de direccionamiento que se utilizaría para la recombinación asistida por MMEJ. Los clones objetivo se seleccionaron mediante PCR como se detalla en la siguiente sección. El neocasete podría escindirse mediante el sistema Flp/FRT después de aislar los clones específicos. NHEJ podría eliminar toda la región del exón 2 entre los dos sitios objetivo de ARNg en caso de que el vector de direccionamiento no estuviera involucrado en la recombinación (Fig. 1C).

La Figura 2 muestra los resultados de la detección por PCR de los clones objetivo. El par de cebadores I detecta la recombinación aguas arriba: se espera una banda de 288 pb del alelo wt y una banda de 322 pb de la recombinación esperada (Fig. 2A). El par de cebadores II amplifica los sitios objetivo que abarcan la inserción del vector: se espera una banda de 1385 pb del alelo wt, una banda de 3001 pb de la recombinación predicha y una banda de 324 pb de la eliminación entre los dos sitios de escisión (Fig. .2A). El par de cebadores III detecta la recombinación aguas abajo: se espera una banda de 314 pb de la recombinación prevista (Fig. 2A).

Detección por PCR de clones específicos. (A) Estructura genómica de los alelos de tipo salvaje, dirigidos y eliminados. Las puntas de flecha negras indican cebadores de PCR. Otras abreviaturas son las mismas que en la Fig. 1B. (B) Resultados del cribado por PCR. Los resultados de los paneles I, II y III se obtuvieron utilizando los pares de cebadores de PCR I, II y III que se muestran en (A), respectivamente. Las bandas cercanas al tamaño esperado se indican con asteriscos y las bandas más largas de lo esperado se indican con puntas de flecha. Los clones marcados con flechas se volvieron a clonar y analizaron como se muestra en (C). Marcador de tamaño de ADN M. (C) Análisis de PCR después de la reclonación. Las bandas rodeadas por rectángulos se purificaron y analizaron adicionalmente mediante secuenciación de lectura larga. Los geles originales de (B) y (C) se presentan en las Figs. complementarias. 4 y 5, respectivamente.

Seleccionamos 48 clones en total (Fig. 2B). Se observó una banda de alrededor de 0,3 kb en algunos clones con el par de cebadores II, lo que indica una eliminación entre los dos sitios de corte (Fig. 2A). Utilizando los pares de cebadores I, II y III, se detectaron bandas esperadas del alelo objetivo en 15, 11 y 25 clones, respectivamente (indicados por asteriscos en la Fig. 2B). Sin embargo, solo cinco clones mostraron las bandas esperadas con todos los pares de cebadores (clones 5, 15, 28, 29 y 39 en la Fig. 2B), lo que indica que con frecuencia se producían patrones de inserción de vectores no deseados. Se observaron bandas más largas de lo esperado (representadas por puntas de flecha en la Fig. 2B) en 21 clones, lo que indica además que el patrón de inserción del vector era diferente de lo esperado. Teóricamente, una inserción detectada con el par de cebadores III puede detectarse con el par de cebadores II si el cebador aguas arriba está presente y la eficiencia de amplificación es suficiente. Sin embargo, de los 14 clones que mostraron bandas más largas de lo esperado con el par de cebadores III, sólo dos clones (clones 21 y 24) mostraron una amplificación correspondiente con el par de cebadores II, lo que sugiere la posibilidad de que la mayoría de las inserciones de vectores estuvieran más allá de la detección. límite con el par de cebadores II.

Con base en estos resultados, consideramos que es necesario dilucidar la naturaleza de las inserciones de vectores imprevistas para evaluar con precisión la calidad de los clones editados con el genoma. Para obtener pistas sobre el mecanismo de la recombinación imprevista, nuestro objetivo fue determinar la secuencia de toda la región de inserciones de vectores. Seleccionamos los siguientes clones, indicados por flechas en la Fig. 2B: primero, clones que mostraron un tamaño de banda mayor de lo esperado para al menos uno de los pares de cebadores (clones 6, 21, 24, 31, 37 y 45). y en segundo lugar, clones sin amplificación por PCR aparte de la presencia de una banda de tamaño natural para el par de cebadores II, aunque la amplificación para el par de cebadores I o III sugirió fuertemente que la inserción del vector se produjo en el sitio objetivo (clones 20, 23, 27, y 44). En tercer lugar, incluimos dos clones que muestran el tamaño de banda esperado para todos los pares de cebadores (clones 29 y 39). El clon 39 mostró una banda muy fuerte de 3 kb para el par de cebadores II acompañada de una banda muy tenue de 1,4 kb de tamaño wt, lo que sugiere que se produjo recombinación bialélica pero una pequeña cantidad de células que contenían alelos wt estaban contaminadas. Por el contrario, el clon 29 mostró una amplificación no despreciable de una banda de tamaño wt de 1,4 kb para el par de cebadores II además de la banda esperada de 3 kb. El clon 29 también mostró dos bandas con diferentes intensidades para los pares de cebadores I y III, lo que sugiere fuertemente la posibilidad de que dos clones se fusionaran durante la formación de colonias de ESC resistentes a G418. Este resultado indica que es necesaria una nueva clonación para analizar con precisión el evento de recombinación.

Por lo tanto, realizamos la reclonación de cada clon colocando células escasamente en placas de cultivo y aislando dos colonias derivadas de una sola célula para cada clon (Fig. 2C). Para el análisis de PCR en la Fig. 2B, se utilizaron lisados ​​​​celulares como plantillas para permitir una detección rápida (consulte "Métodos" para obtener detalles del procedimiento). Por otro lado, para aumentar la sensibilidad de detección de la PCR, el ADN genómico de las células reclonadas se preparó con alta pureza mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Además, el tiempo de elongación se extendió de 3 min (Fig. 2B) a 8 min (Fig. 2C) para poder amplificar secuencias de inserción largas. En algunos casos, solo uno de los subclones mostró una banda o ambos subclones no mostraron ninguna banda (Fig. 2C), lo que sugiere que se mezcló más de un clon antes de volver a clonar. La banda de tamaño wt de 1,4 kb que se observó en la Fig. 2B desapareció para el clon 29, lo que sugiere que este clon puede haber tenido la inserción de vector esperada en ambos alelos. Es importante destacar que en el clon 44 observamos una nueva banda que era más grande de lo previsto (Fig. 2C) y no fue visible en la primera prueba de PCR (Fig. 2B). Este resultado demuestra que un patrón de inserción de vector no deseado puede escapar a la detección mediante el procedimiento de detección por PCR estándar.

La Figura 3A ilustra la estrategia de secuenciación. Primero, la banda de PCR se clonó en un plásmido. Dado que la banda de PCR era más grande de lo esperado, es posible que hubiera secuencias repetidas en los productos de PCR, como la inserción de dos copias del vector. Por tanto, utilizamos el secuenciador de lectura larga MinION, que es capaz de analizar secuencias repetitivas. Las secuencias consenso de las secuencias leídas se obtuvieron utilizando una herramienta de ensamblaje, Flye16 (Figura complementaria 2). Luego se estimó el patrón de inserción del vector comparando las secuencias consenso con el vector y las secuencias genómicas. En la secuenciación MinION, los errores de secuencia de nucleótidos ocurren con alta frecuencia, por lo que se debe tener cuidado al interpretar la secuencia consenso. Por lo tanto, las secuencias de las uniones de recombinación entre el genoma y el vector o entre dos vectores, que fueron estimadas por MinION, también se determinaron mediante secuenciación directa de Sanger de los productos de PCR que se muestran en la Fig. 2C. Todas las secuencias diana de los gRNA también se determinaron mediante el método de Sanger. Incluso cuando un sitio objetivo de ARNg no estuvo involucrado en la recombinación con el vector de direccionamiento como se muestra más adelante, la presencia de la mutación en el sitio objetivo de ARNg demostró que la secuencia objetivo fue escindida por el complejo Cas9/ARNg.

Análisis de secuencia de lectura larga de inserción de vectores. (A) Descripción general del análisis de secuencia de lectura larga. (B) Ejemplo de anotación de una secuencia consenso obtenida mediante ensamblaje de novo de datos de secuenciación de lectura larga. También se muestran ejemplos de secuenciación directa utilizando el método Sanger, realizada para confirmar la fidelidad del ensamblaje. (C) Anotación de los resultados de la secuenciación de Sanger en las regiones I, II y III que se muestran en (B).

Las Figuras 3B, C muestran un ejemplo del análisis del clon 37 (Fig. 2C), y el patrón de recombinación inferido de este análisis se muestra en la Fig. 4F. En este ejemplo, NHEJ unió dos vectores y los insertó en el genoma. En el sitio de enlace del vector, se eliminó una secuencia de aproximadamente 1,2 kb en uno de los vectores (Fig. 3B, C). El vector vinculado se insertó en el genoma mediante HR entre las secuencias del exón 2 en la región aguas arriba y por el MMEJ originalmente previsto en la región aguas abajo (Figs. 3B, C, 4F). Aunque el sitio objetivo del ARNg aguas arriba no participó en la recombinación con el vector, se detectó una mutación en este sitio mediante la secuenciación de Sanger (Fig. 3B, C), lo que confirma que sí se produjo la escisión.

Patrones de recombinación inferidos de secuenciación de lectura larga. Cada patrón de recombinación se infirió en base a los resultados mostrados en la Fig. 3B, C para el clon 37 y en la Fig. 3 complementaria para otros clones.

Se realizó el mismo análisis que en la Fig. 3B, C para todos los clones, como se detalla en la Fig. 3 complementaria. Los patrones de recombinación inferidos del análisis se muestran en la Fig. 4. En muchos casos, solo un sitio de escisión del genoma o el vector participó en la recombinación (clones 6, 21, 24, 27, 31, 37, 44 y 45). Dado que un par de microhomología del genoma y el vector debe estar expuesto mediante una rotura de doble cadena para que se produzca MMEJ (Fig. 1), MMEJ no podría ocurrir en estos clones ni en la región ascendente ni en la descendente. En cambio, se observó NHEJ o HR en dichas regiones. Como resultado, diferentes combinaciones de vías de reparación, es decir, NHEJ y MMEJ (clones 6, 31, 44 y 45 en la Fig. 4), HR y MMEJ (clon 27 en la Fig. 4), HR y NHEJ (clon 24) en la Fig. 4), y HR, NHEJ y MMEJ (clon 37 en la Fig. 4), estuvieron involucrados en las inserciones de vectores. En un caso, se produjo NHEJ, no MMEJ, aunque la microhomología debe haber estado presente en el sitio de escisión (clon 21).

Como se muestra arriba, la recombinación en un solo sitio de escisión en el genoma o el vector dará como resultado la inserción de una secuencia no deseada en el genoma. Se descubrió que esta era una de las razones de la presencia de bandas de PCR no deseadas de tamaño mayor de lo esperado. Si solo se utiliza un sitio de escisión en el vector para la recombinación, el tamaño de la banda de PCR aumentará considerablemente debido a la inserción de la columna vertebral del vector de 2,7 kb en el genoma (clones 6, 24, 31 y 44 en la Fig. 4). . Además, si solo un sitio de escisión está involucrado en la recombinación tanto en el genoma como en el vector como en el caso del clon 44 (Fig. 4G), la banda será 3,8 kb más larga de lo esperado, lo que resultará en una reducción sustancial en la sensibilidad de detección. de PCR. De hecho, la secuencia del vector de longitud completa no pudo amplificarse mediante la PCR inicial para el clon 44 (Fig. 2B) y se amplificó sólo después de aumentar el tiempo de extensión de la PCR de 3 a 8 minutos y usar una plantilla de ADN genómico altamente purificada (Fig. .2C). El enlace de múltiples vectores también aumenta significativamente el tamaño de la inserción del vector, como se observa en el clon 37 (Fig. 4F).

Curiosamente, no había ningún marcador de selección presente en el sitio de integración para el clon 27. Dado que todos los clones fueron seleccionados para resistencia a G418, probablemente se insertó otra copia de la secuencia del vector en el genoma. Respaldando esta suposición, el par de cebadores III detectó una banda ligeramente más grande que el tamaño esperado (Fig. 2B), lo que indica la inserción del vector en el otro alelo a través de NHEJ. Se descubrió que los dos clones que mostraban las bandas de PCR esperadas para todos los pares de cebadores habían sufrido una recombinación mediada por MMEJ como se esperaba (clones 29 y 39).

En conjunto, se identificaron ocho clones mediante análisis de secuenciación de lectura larga que tenían patrones de recombinación no deseados. Dado que inicialmente se examinaron 48 clones mediante PCR, la frecuencia de patrones de recombinación no deseados fue del 17% (ocho de 48). Consideramos que esta frecuencia es una subestimación porque 11 clones más mostraron bandas de PCR más largas de lo esperado (Fig. 2B) pero no se analizaron en detalle (ver "Discusión").

Los resultados mostrados anteriormente indican que la recombinación no deseada puede generar alelos que pueden escapar a la detección mediante PCR. Esto es especialmente importante cuando se busca la modificación del genoma homocigoto, que era el objetivo original de este estudio. Los clones 29 y 39 comprendían candidatos para la modificación del genoma homocigótico porque la recombinación esperada inducida por MMEJ se demostró mediante análisis de secuencia (Fig. 4E) y no se detectaron alelos wt mediante PCR después de la reclonación (Fig. 2C). Sin embargo, sigue existiendo la posibilidad de que la recombinación mediada por MMEJ ocurriera solo en un alelo, mientras que en el otro alelo se insertó una secuencia grande no detectable por PCR. Para excluir esta posibilidad, rediseñamos el cribado por PCR. Se configuró un par de cebadores para amplificar los SNP heterocigotos aguas arriba y aguas abajo del sitio objetivo (Fig. 5A). Usando este par de cebadores, volvimos a analizar los clones 29 y 39 y obtuvimos una banda única como se esperaba (Fig. 5B, izquierda). La secuenciación de ambos extremos de esta banda reveló la presencia de SNP heterocigotos (Fig. 5B, derecha). Esto confirmó que la recombinación prevista se produjo en ambos alelos de estos clones. Para verificar la funcionalidad de los sitios loxP, el clon 39 se sometió a 4-hidroxitamoxifeno (4HT) para inducir la actividad de la recombinasa Cre (Fig. 6A). El resultado de la PCR fue consistente con la recombinación entre sitios loxP (Fig. 6B). Además, las ESC tratadas con 4HT mostraron sensibilidad a G418 (Fig. 6C), lo que indica una eliminación exitosa del casete de neoexpresión mediante la recombinación entre sitios loxP. Estos resultados demuestran la funcionalidad de los sitios loxP introducidos por recombinación mediada por MMEJ.

Análisis alélico de recombinación utilizando SNP heterocigotos. (A) Estructura del alelo objetivo de los clones 29 y 39. Las ubicaciones de los SNP heterocigotos para distinguir los alelos C57BL/6J y 129S6/SvEvTac se muestran mediante las coordenadas genómicas del ensamblaje del genoma mm10. (B) Producto de PCR de la secuencia de inserción de longitud completa (izquierda) y análisis de SNP mediante secuenciación de Sanger (derecha). Se detectó heterocigosidad en todos los SNP, lo que indica eventos dirigidos de manera homocigótica. M, marcador de tamaño de ADN. El gel original se presenta en la figura complementaria 6.

Recombinación mediada por Cre/loxP inducida por 4HT en el clon ESC modificado bialélicamente. (A) Estructura genómica de los alelos de tipo salvaje, dirigidos y recombinados. En este experimento se utilizó el clon 39, que se demostró que tenía modificaciones bialélicas en la Fig. 5. La línea ESC parental contiene el casete ERT2-iCre-ERT2 en el locus Rosa26 y el tratamiento con 4HT induce la actividad recombinasa de Cre. Las puntas de flecha negras indican cebadores de PCR. Otras abreviaturas son las mismas que en la Fig. 1B. (B) Resultados del cribado por PCR. Los resultados de los paneles I y II se obtuvieron utilizando los pares de cebadores de PCR I y II que se muestran en (A), respectivamente. M, marcador de tamaño de ADN. Los geles originales se presentan en la figura complementaria 7. (C) Sensibilidad a G418 de las ESC después del tratamiento con 4HT. − 4HT sin 4HT, + 4HT con 4HT. Barra de escala, 500 µm.

Los resultados actuales indican que secuencias exógenas largas que escapan a la detección mediante el cribado por PCR convencional se pueden insertar en el sitio objetivo en la edición del genoma. Es importante dilucidar el mecanismo subyacente a una recombinación tan compleja para evaluar con precisión los clones editados con genoma. Por ejemplo, la pérdida del alelo wt por PCR puede malinterpretarse como un evento dirigido homocigotamente en lugar de atribuirse a la inserción de secuencias exógenas largas más allá del límite de detección de la PCR. Para obtener pistas para la caracterización de eventos de recombinación tan complejos, analizamos clones que contienen inserciones de secuencias exógenas largas utilizando la tecnología de secuenciación de lectura larga Nanopore. Los análisis revelaron la participación de vías de reparación no deseadas, como NHEJ y HR, en la inserción del vector, lo que da como resultado una recombinación que puede ser difícil de detectar mediante la detección por PCR convencional. Con base en estos hallazgos, supusimos la importancia de distinguir la recombinación entre alelos y rediseñamos el análisis de PCR utilizando SNP heterocigotos (Fig. 5).

En total, determinamos las secuencias completas de las inserciones de vectores en ocho clones de 48 clones seleccionados por PCR (Figs. 3, 4, Figs. 2, 3 complementarias). Por lo tanto, se demostró que el 17% de las inserciones eran patrones imprevistos que involucraban no solo a MMEJ sino también a NHEJ y HR. Sin embargo, cabe señalar que esta frecuencia está subestimada porque 11 clones adicionales mostraron bandas más largas de lo esperado en la detección por PCR inicial, pero no se analizaron más a fondo (Fig. 2B). Si incluimos estos 11 clones, la frecuencia de recombinación compleja alcanza el 40%. Esta observación sugiere firmemente que se debe tener mucho cuidado en el control de calidad de los clones editados con genoma.

Para generar alelos condicionales en el locus del gen Klf2 del ratón, utilizamos un método de edición del genoma mediado por MMEJ llamado PITCh. Los métodos mediados por HR se utilizan con mayor frecuencia para la inserción de secuencias exógenas. HR usa secuencias homólogas de 500 a 1000 pb en los vectores de direccionamiento9, mientras que MMEJ usa secuencias homólogas cortas de 5 a 40 pb12,13,17,18. En el presente estudio, nuestro objetivo fue insertar una secuencia loxP de solo 34 pb. Por lo tanto, consideramos que el método PITCh, con su brazo de homología corto, es más adecuado para detectar el aumento en la longitud del producto de PCR después de la recombinación en comparación con el método mediado por HR que utiliza brazos de homología más largos (Fig. 2B). Sin embargo, observamos una alta frecuencia de recombinación no deseada. Una posible razón para esto es que tanto el genoma como el vector debían ser escindidos por Cas9/gRNA en dos ubicaciones (Fig. 1B) pero, en realidad, no se escindieron simultáneamente en células cultivadas. Hasta donde sabemos, hay dos informes del método PITCh basado en MMEJ en los que tanto el genoma como el vector se cortaron en dos ubicaciones. En ambos estudios la recombinación esperada se observó con mayor frecuencia que en nuestro caso17,18. Sin embargo, ambos experimentos se realizaron utilizando huevos de ratón fertilizados. Todos los sitios objetivo de ARNg se escindirían sin problemas en los óvulos fertilizados porque se les pueden inyectar altas concentraciones de ribonucleoproteínas (RNP) de ARNg Cas9 y vectores de dirección. Por lo tanto, es difícil realizar una comparación directa con el presente estudio, que utilizó células cultivadas. En el presente estudio, sólo un sitio objetivo de ARNg en el genoma o en el vector estuvo involucrado en la recombinación entre el genoma y el vector en ocho clones (clones 6, 21, 24, 27, 31, 37, 44 y 45 en Figura 4). Todos los sitios objetivo de ARNg que no participaron en la recombinación se mutaron en seis de ocho clones (Fig. 4), lo que indica que sí se produjo la escisión de ARNg. Quizás los sitios objetivo del ARNg se escindieron en diferentes momentos y, por lo tanto, no pudieron utilizarse de manera eficiente para la recombinación mediada por MMEJ. Los extremos escindidos del vector de direccionamiento en PITCh darían como resultado la inserción del vector mediada por NHEJ en el genoma cuando la microhomología en el genoma no quedó expuesta por una rotura de doble hebra. Un experimento de control que involucre un único sitio de corte de ARNg en el locus genómico, así como el vector de direccionamiento, ayudaría a identificar la causa de la recombinación no deseada. Por el contrario, en la edición del genoma convencional basada en HR, los vectores de dirección se utilizan en forma circular, lo que puede reducir la frecuencia de inserción del vector a través de NHEJ. Sin embargo, un informe reciente mostró que se insertaron un vector de expresión de ARNg circular y ADN mitocondrial en sitios de escisión genómica durante la edición del genoma utilizando CRISPR-Cas98. Por lo tanto, incluso con HR usando un vector de dirección circular, el vector podría insertarse en el genoma de una manera inesperada. Un estudio demostró que la linealización del vector de direccionamiento mejora la eficiencia de la edición del genoma basada en recursos humanos19. Los autores también observaron que NHEJ puede ocurrir entre sitios de escisión genómica y vectores linealizados, pero no determinaron la secuencia de inserción completa, como se hizo en el presente estudio. Según los resultados de nuestro estudio, creemos que cuando se utilizan vectores linealizados en la edición del genoma basada en HR, se debe prestar suficiente atención a las inserciones de vectores no deseadas que son difíciles de detectar mediante PCR.

El análisis de PCR después de la reclonación mostró una mayor amplificación de las bandas no deseadas o la aparición de nuevas bandas que eran indetectables antes de la reclonación (Fig. 2C). Una posible razón para esto es que el tiempo de extensión se incrementó de 3 a 8 min. Otro factor puede haber sido el uso de ADN genómico altamente purificado mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol como plantilla de PCR después de la reclonación, mientras que se usaron lisados ​​​​celulares como plantilla antes de la reclonación. Sin embargo, si la secuencia insertada es extremadamente larga, la amplificación por PCR fallaría incluso en condiciones mejoradas. Por ejemplo, se podrían unir e insertar tres o más vectores dirigidos en el genoma, y ​​dicha recombinación estaría más allá del límite de detección de la PCR. De hecho, cuando se crean ratones transgénicos mediante la microinyección de ADN vectorial en óvulos fertilizados, se pueden insertar cientos de copias de ADN vectoriales dispuestos en tándem en sitios específicos del genoma20, y lo mismo puede suceder en células cultivadas. Por lo tanto, al evaluar la calidad de los clones editados con genoma, siempre se debe considerar la posibilidad de la inserción de secuencias exógenas largas que superen el límite de detección de la PCR. A este respecto, sería útil el análisis de PCR utilizando SNP heterocigotos como se muestra en la Fig. 5. Sin embargo, los SNP heterocigotos no siempre se encuentran en las proximidades del sitio objetivo. En tales casos, sería útil construir dos vectores de direccionamiento con diferentes marcadores de selección y modificar cada alelo con un vector diferente. Estimar el número de copias del ADN del vector insertado mediante técnicas como la PCR cuantitativa o la PCR digital en gotas ayudaría en la identificación de clones candidatos con inserción de vector bialélico. Además, la amplificación por PCR del esqueleto del vector puede ser valiosa para excluir la recombinación no deseada asociada con la inserción del esqueleto del vector y la inserción aleatoria del vector de direccionamiento fuera de la región objetivo.

Realizamos una secuenciación de lectura larga con tecnología Nanopore para obtener una imagen completa de los complejos patrones de recombinación. El ensamblaje de lectura larga es más efectivo que el ensamblaje de lectura corta cuando hay secuencias repetidas. Nuestro análisis detectó casos en los que dos copias de los vectores estaban unidas e insertadas en el genoma (clon 37 en la Fig. 4) o dos copias del exón 2 estaban presentes después de la recombinación (clones 21, 37, 44 y 45 en la Fig. 4). ). Cuando se insertó la columna vertebral del vector de direccionamiento (clones 6, 24, 31 y 44 en la Fig. 4), hubo una superposición de secuencia de aproximadamente 3 kb entre el inserto clonado y la columna vertebral de los vectores de clonación. Estos eventos de recombinación habrían sido difíciles de analizar con una secuenciación de lectura corta. Por otro lado, la secuenciación de lectura larga tiene el inconveniente de una baja precisión de secuencia. Para complementar esta debilidad, realizamos la secuenciación directa de los productos de PCR que se muestran en la Fig. 2C y confirmamos las secuencias de nucleótidos de las uniones de recombinación que se supusieron a partir de las secuencias de lectura larga. Los resultados de la secuenciación de Sanger coincidieron con la secuencia consenso inferida de la secuenciación de lectura larga en casi todos los casos. Por lo tanto, el análisis de secuenciación de lectura larga es una estrategia poderosa para analizar patrones de recombinación complejos en los que se supone que existen secuencias repetidas. Cabe señalar que nuestro análisis de secuenciación de lectura larga estuvo sesgado hacia inserciones de vectores que podrían amplificarse mediante PCR. Para lograr una caracterización imparcial de los eventos de inserción, un enfoque de captura dirigida que utilice oligonucleótidos complementarios a la secuencia del vector, seguido de un análisis de secuenciación de lectura larga, proporcionaría información valiosa. Este enfoque también nos permitiría investigar el logro de la inserción bialélica, particularmente cuando no hay SNP cercanos presentes en el sitio objetivo. Además, facilitaría la detección de inserciones de vectores ubicadas distantes del sitio objetivo, ofreciendo valiosa información de control de calidad para los clones objetivo.

Este estudio demostró que MMEJ, NHEJ y HR participan en varias combinaciones durante la recombinación del vector y el genoma. Informes anteriores han demostrado que NHEJ ocurre a lo largo del ciclo celular, mientras que MMEJ y HR están activos principalmente desde la fase M hasta la fase S temprana y desde la fase S tardía hasta la fase G2, respectivamente10,14. Por lo tanto, pensamos que era poco probable que HR y MMEJ coexistieran. Sin embargo, MMEJ y HR coexistieron en dos recombinantes analizados mediante secuenciación de lectura larga (clones 27 y 37 en la Fig. 4). Esto sugiere que el rango de fases del ciclo celular con alta actividad de MMEJ y HR podría ser más amplio de lo que se pensaba anteriormente, al menos en las ESC. Alternativamente, es posible que haya ocurrido un evento de recombinación, seguido de otro después de que el ciclo celular hubiera progresado. En el ejemplo en el que dos vectores se unieron e insertaron en el genoma, MMEJ, NHEJ y HR estuvieron involucrados (clon 37 en las figuras 3B, C, 4F). Este resultado indica que se utilizan diferentes vías de manera flexible para reparar roturas de doble hebra en el genoma, lo que puede ser una estrategia general para que los organismos mantengan la integridad del genoma.

Para obtener eficazmente el recombinante deseado, puede resultar útil aumentar la actividad de la vía de recombinación deseada o inhibir otras vías de recombinación. Para el método PITCh, puede ser útil aumentar la eficiencia de MMEJ mediante la expresión forzada de un potenciador de MMEJ como la exonucleasa 118 o mediante el uso de inhibidores de HR o NHEJ21. Para inducir MMEJ de manera eficiente, todos los sitios objetivo de ARNg deben escindirse simultáneamente para exponer las microhomologías para la recombinación. Para ello, anteriormente se propuso utilizar el mismo ARNg para cortar el vector de direccionamiento y el genoma19. Alternativamente, una versión mejorada de Cas922 o gRNA23 puede resultar eficaz. La utilización de RNP de ARNg de Cas9 puede facilitar la escisión de todos los sitios objetivo de ARNg en un período de tiempo más corto en comparación con Cas9 y ARNg expresados ​​a partir de un plásmido. Sin embargo, se debe tener precaución para evitar la escisión del vector objetivo por parte de las RNP cuando se combinan antes de la transfección. El vector de direccionamiento debe sufrir escisión dentro de las células transfectadas para facilitar la transferencia eficiente del ADN del vector linealizado a la vía MMEJ. Para excluir clones con la inserción de la columna vertebral del vector de direccionamiento en el genoma, se coloca un marcador de selección negativa como el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple en la columna vertebral y se realiza una selección negativa usando ganciclovir o 1-2′-desoxi-2′-fluoro- El beta-d-arabinofuranosil-5-yodouracilo (FIAU) puede ser útil24.

En conjunto, la caracterización de recombinantes no deseados realizada en este estudio proporcionará pistas para mejorar la eficiencia de la edición del genoma y el control de calidad de los clones editados con genoma.

En este estudio se utilizó la línea ESC de ratón GNL35REC4dn7 (no publicada), un derivado de la línea ESC de ratón KY1.125. KY1.1 es un híbrido de los orígenes genéticos del ratón C57BL/6J y 129S6/SvEvTac; por lo tanto, se pueden utilizar SNP heterocigotos para distinguir alelos. La línea ESC GNL35REC4dn7 contiene el gen de la proteína fluorescente Nano-lantern26 y el casete ERT2-iCre-ERT227 en los loci Gm13227 y Rosa2628, respectivamente. Las modificaciones genéticas en el locus Gm13227 son irrelevantes para el propósito del presente estudio. Las ESC se cultivaron en KnockOut DMEM (Thermo Fisher Scientific; 10829018) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 20 %, aminoácidos no esenciales (Thermo Fisher Scientific; 11140050), 2-mercaptoetanol 0,1 mM, factor inhibidor de la leucemia 1000 U/ml ( LIF; Millipore; ESG1107), 1 µM del inhibidor de MEK PD0325901 (Axon Medchem; 1408) y 3 µM del inhibidor de GSK3 CHIR99021 (Axon Medchem; 1386). Al agregar PD0325901 y CHIR99021, llamado 2i, al medio de cultivo, las ESC podrían cultivarse en un estado indiferenciado en placas recubiertas de gelatina sin células alimentadoras. La ausencia de células alimentadoras permitió evitar la contaminación de las células salvajes en el análisis de PCR. Para evaluar la recombinación Cre/loxP en clones de ESC modificados bialélicamente, las ESC se sembraron escasamente en pocillos recubiertos de gelatina en medio de cultivo que contenía 2i con o sin 4HT 1 µM. Al día siguiente, las ESC se sometieron a selección utilizando 250 µg/ml de G418 y se determinó su sensibilidad al G418 después de 6 días de selección.

Tanto Cas9 como los ARNg se expresaron utilizando el vector pX33015. Los oligonucleótidos complementarios correspondientes al ARNg de PITCh, el ARNg de Klf2 en sentido ascendente (ARNg-1) y el ARNg descendente de Klf2 (ARNg-2) se hibridaron y clonaron en el sitio BbsI de pX330, lo que dio como resultado la generación de pX330-PITCh, pX330. -gRNA-1 y pX330-gRNA-2 respectivamente. Los oligonucleótidos utilizados para la construcción del vector se enumeran en la Tabla complementaria 1.

El vector de direccionamiento Klf2 se construyó de la siguiente manera utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 1 y la secuencia de nucleótidos completa del vector de direccionamiento se muestra en la Fig. 1 complementaria. pPGKneo-F2F (obsequio del Dr. K. Yusa) que contiene el vector de direccionamiento flanqueado por FRT El casete de neoselección se digirió con SacII y NotI adyacentes al casete neo. Paralelamente, se amplificaron mediante PCR fragmentos genómicos del gen Klf2 de ratón de la región promotora al intrón 1 y del intrón 1 al intrón 2 utilizando los pares de cebadores Klf2-5HR-F1 y Klf2-5HR-R1 y Klf2-5HR-F2 y Klf2-5HR-R2, respectivamente. Los extremos 5' de Klf2-5HR-R1 y Klf2-5HR-F2 son complementarios entre sí y contienen la secuencia loxP. Los extremos 5' de Klf2-5HR-F1 y Klf2-5HR-R2 son complementarios a la secuencia del vector pPGKneo-F2F adyacente a los sitios de digestión SacII y NotI, respectivamente. Por lo tanto, los dos fragmentos de PCR se pudieron ensamblar y clonar en el sitio SacII-NotI de pPGKneo-F2F utilizando el kit In-Fusion Cloning HD (Takara; 639648), lo que dio como resultado la generación de pPGKneo-F2F-Klf2-5HR. El fragmento genómico Klf2 desde el intrón 2 hasta la región no traducida del exón 3 se sintetizó (GenScript) y se clonó en el sitio HindIII-SbfI de pPGKneo-F2F-Klf2-5HR ubicado en el lado opuesto del sitio NotI con respecto al casete neo. dando como resultado la generación de pPGKneo-F2F-Klf2-5HR-3HR-mod. Se introdujo un sitio loxP en el fragmento Klf2 sintético de modo que estuviera ubicado adyacente al casete neo flanqueado por FRT de pPGKneo-F2F-Klf2-5HR-3HR-mod. Para generar el vector dirigido a PITCh, se sintetizó un fragmento de ADN que contenía un sitio objetivo de PITCh-gRNA, una secuencia de microhomología 5', un sitio loxP, un sitio BglII y AscI, una secuencia de microhomología 3' y un sitio objetivo de PITCh-gRNA12 en este orden y se clonó. en el vector pUC57, lo que da como resultado la generación de pPITCh-bk. El fragmento BglII-AscI de pPGKneo-F2F-Klf2-5HR-3HR-mod que contiene el fragmento Klf2 intrón1-intrón 2, el casete neo flanqueado por FRT y un sitio loxP se clonó en el sitio BglII-AscI de pPITCh-bk, dando como resultado en la producción del vector dirigido a PITCh pKlf2-cKO-PITCh.

El día 0, las ESC (2,5 × 105) se mezclaron con 1,25 µg de pKlf2-cKO-PITCh, 0,42 µg de cada vector Cas9/gRNA (pX330-PITCh, pX330-gRNA-1 y pX330-gRNA-2) y 5 µl de TransFast (Promega; E2431) en un medio que contiene suero en un volumen total de 500 µl y se sembraron en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Después de 1 h, se añadió 1 ml de medio al pocillo y el medio se reemplazó con medio nuevo 3 h después de la transfección. El día 1, las ESC se pasaron a una placa de 6 cm y se seleccionaron usando 250 µg/ml de G418. El día 9, las colonias ESC se recogieron y se dividieron en preparaciones de lisados ​​para análisis por PCR y cultivos celulares para volver a clonar y preparar reservas de células congeladas. Los lisados ​​de ESC se prepararon resuspendiendo los sedimentos de ESC en 20 µl de agua y calentándolos a 95 °C durante 10 min, seguido de digestión con proteinasa K (400 µg/ml) a 56 °C durante 60 min e inactivación por calor de la proteinasa K a 95 °C. C durante 10 min. Para un análisis detallado de la secuencia insertada, algunos clones de ESC se sembraron escasamente en placas de cultivo para obtener colonias derivadas de células individuales. Después de seleccionar colonias, las ESC se expandieron y el ADN genómico se purificó mediante el método convencional de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol29.

Los clones objetivo se examinaron mediante PCR utilizando la polimerasa KOD FX (TOYOBO; KFX-101) con los cebadores que se muestran en la Tabla complementaria 1. Para el primer cribado de los clones objetivo (Fig. 2B), se utilizó lisado de ESC como plantilla. Para la recombinación aguas arriba y aguas abajo (pares de cebadores I y III en la Fig. 2), las condiciones de la PCR fueron las siguientes: un ciclo a 94 °C durante 2 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 10 s, recocido a 55 °C durante 30 s, y extensión a 68 °C durante 30 s, con un paso de extensión final a 68 °C durante 1 min. Para la amplificación de secuencias de inserción de longitud completa (par de cebadores II en la Fig. 2), el tiempo de extensión del ciclo de PCR y el tiempo de extensión final después del ciclo de PCR se establecieron en 3 minutos. Al analizar las células reclonadas (Fig. 2C), se utilizó como plantilla el ADN genómico purificado mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Las condiciones de la PCR fueron las mismas que para el análisis del lisado, excepto que el tiempo de extensión del ciclo de PCR se estableció en 8 minutos y el tiempo de extensión final después del ciclo de PCR se estableció en 5 minutos para permitir la detección de secuencias de inserción largas. Las condiciones de la PCR para el análisis de SNP heterocigótico (Fig. 5B) y la recombinación Cre/loxP (Fig. 6B) fueron las mismas que las utilizadas en el primer cribado por PCR utilizando lisado ESC (Fig. 2B), excepto que el tiempo de extensión de la PCR El ciclo y el paso de extensión final se establecieron en 4 min y 5 min, respectivamente, en el análisis de SNP.

Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen; 28704) y se clonaron en un plásmido utilizando el kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO (Thermo Fisher Scientific; 450245). El ADN plasmídico se purificó utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen; 27106), se digirió con BsrGI y se purificó con el kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen; 28104). La secuenciación de lectura larga se realizó en un secuenciador MinION (Oxford Nanopore Technologies) utilizando el kit de secuenciación de ligadura 1D (Oxford Nanopore Technologies; SQK-LSK109) y el kit de códigos de barras nativos (Oxford Nanopore Technologies; EXP-NBD103). Las lecturas de secuencia sin procesar se ensamblaron utilizando Flye versión 2.616.

Los productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen; 28104) o el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen; 28704) y se secuenciaron directamente utilizando el kit de secuenciación de ciclos BigDye Terminator v3.1 (Thermo Fisher Scientific; 4337455). Toda la secuenciación de Sanger se realizó en productos de PCR, no en el ADN plasmídico con el fragmento amplificado por PCR insertado, para evitar cualquier sesgo causado por mutaciones inducidas por PCR.

Los datos de secuenciación de lectura larga están disponibles en el Archivo de lectura de secuenciación del Banco de datos de ADN de Japón (DDBJ) con los números de acceso DRA015430.

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Agradecemos a las instalaciones centrales de NGS del Centro de Investigación de Información del Genoma del Instituto de Investigación de Enfermedades Microbianas de la Universidad de Osaka por su apoyo con la secuenciación de nanoporos y el análisis de datos. Agradecemos al Dr. Junji Takeda por proporcionar ESC KY1.1 y al Dr. Kosuke Yusa por el plásmido pPGKneo-F2F. Este trabajo fue apoyado por subvenciones para investigación científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (JP20H03174 para KH)

Departamento de Fisiología II, Universidad Médica de Nara, Kashihara, Nara, 634-8521, Japón

Yuki Higashitani y Kyoji Horie

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KH concibió el estudio. YH y KH realizaron los experimentos. YH analizó los resultados de la secuenciación de Nanopore. YH y KH escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Kyoji Horie.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Higashitani, Y., Horie, K. El análisis de secuencia de lectura larga de la edición del genoma CRISPR mediada por MMEJ revela inserciones complejas de vectores en el objetivo que pueden escapar al control de calidad estándar basado en PCR. Informe científico 13, 11652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38397-y

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Recibido: 19 de abril de 2023

Aceptado: 07 de julio de 2023

Publicado: 19 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38397-y

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