Más allá del recuento total en placa: aplicaciones metagenómicas para procesadores de carnes y aves de corral

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La planta procesadora comercial de carne o aves de hoy es una red compleja de equipos, automatización, interacción humana y múltiples procesos/vías. Estos componentes trabajan juntos para fabricar de manera eficiente una carcasa en múltiples cortes primarios, subprimarios y de recorte que se utilizarán para su posterior procesamiento. Aquí, pueden envasarse crudos o procesarse posteriormente para obtener productos cárnicos listos para el consumo (RTE). En esencia, este flujo de trabajo ha tenido éxito durante miles de años al poder crear una amplia variedad de cortes individuales de carne y productos cárnicos procesados, como salchichas, algo que ya se mencionó en la Odisea de Homero, escrita hace aproximadamente 10.000 años. .

Si bien los procesos han cambiado y se ha incorporado tecnología avanzada, una constante a lo largo de la evolución de la industria cárnica ha sido la contribución de un microbioma biológicamente muy diverso. Este microbioma puede contener miles de especies diferentes de bacterias, virus y hongos que viven juntos como una comunidad y residen en el animal, el entorno de procesamiento y las superficies de la carne. La presencia de bacterias específicas dentro de la comunidad microbiana puede tener efectos tanto positivos como negativos sobre la seguridad y salubridad de la carne producida. La vida útil de los productos cárnicos frescos y procesados ​​está fuertemente influenciada por la proliferación de especies bacterianas seleccionadas dentro del microbioma de la carne en condiciones ambientales, lo que puede dar como resultado características indeseables del producto y una experiencia poco favorable para el consumidor. Además, un enfoque crítico de la industria cárnica y avícola ha sido la eliminación de patógenos específicos transmitidos por los alimentos dentro del microbioma del entorno animal, vegetal y, en última instancia, de la carne que compra el consumidor.

Los procesadores de carne y aves cuentan con varias herramientas para comprender el contexto de la ecología microbiana a lo largo de toda la cadena de suministro, desde la granja hasta la mesa. La industria ha utilizado técnicas basadas en cultivos durante décadas y siguen siendo una herramienta importante para comprender bien la carga microbiana y la presencia de patógenos seleccionados. Sin embargo, los avances en la secuenciación de próxima generación han permitido comprender los habitantes microbianos que componen el microbioma de una manera que las técnicas basadas en cultivos son limitadas.

Cuando se les da una caja de herramientas llena de herramientas, los procesadores deben poder determinar qué herramienta se aplica mejor a la pregunta de investigación que se plantea. Además, los procesadores de carne y aves no tienen presupuestos de investigación ilimitados para poder responder estas preguntas. Un enfoque reflexivo y estratégico del objetivo general de la prueba puede permitir a los procesadores seleccionar la herramienta más adecuada para el trabajo. El objetivo de este artículo es proporcionar una visión general amplia de dos técnicas genómicas y aplicaciones potenciales para su uso en procesadores de carne y aves.

Albert Einstein dijo la famosa frase:"Si tuviera una hora para resolver un problema y mi vida dependiera de la solución, dedicaría los primeros 55 minutos a determinar la pregunta adecuada a formular... porque una vez que sepa la pregunta adecuada, podría resolver el problema en menos de cinco minutos. "

Este enfoque ciertamente se aplica a los procesadores de carne y aves de corral cuando comienzan a establecer lo que se necesita aprender a través de las pruebas. Esta es también la parte del proceso que tiende a recibir la menor cantidad de atención cuando los procesadores se enfrentan a una crisis y se necesitan respuestas rápidamente. Tener la disciplina para definir claramente la pregunta de investigación permite a los procesadores determinar el objetivo general de las pruebas y ayudará a evitar la trampa de "probar por probar", que a menudo es costoso y requiere mucha mano de obra tanto para la planta como para el laboratorio. y en ocasiones no responde adecuadamente a la pregunta. Una vez establecida la pregunta de investigación, se puede aplicar un diseño de prueba eficiente y métodos apropiados para responder la pregunta.

Varias técnicas se presentan como opciones viables a la hora de determinar la cantidad de bacterias y un conocimiento amplio de cuáles de ellas están presentes en la muestra que se está tomando. Las técnicas basadas en cultivos pueden proporcionar información sobre la consistencia de la población microbiana y, lo que es más importante, qué puede crecer en las condiciones que se utilizan en el laboratorio. Estratégicamente, comenzar de manera amplia con pruebas basadas en cultivos permitirá a los procesadores comprender las tendencias generales dentro de la ecología microbiana del medio ambiente o de la carne. Se puede aprender mucho del recuento de placas aeróbicas que puede resultar útil para tomar decisiones sobre los cambios en la carga bacteriana. Además, observar las morfologías de las colonias y las características de crecimiento puede dar una idea general de si las poblaciones bacterianas pueden estar cambiando, ya sea con el tiempo o a lo largo de un determinado flujo de trabajo. Los métodos basados ​​en cultivos también son económicamente viables y pueden ser apropiados para actividades de seguimiento de rutina.

La Figura 1 muestra los recuentos de aeróbicos mesófilos en placa de dos tipos diferentes de carne muestreados el mismo día. El recuento total de colonias de cada placa puede proporcionar una idea de la carga microbiana. La presencia de diferentes morfologías de colonias o características de crecimiento puede proporcionar una idea amplia de la diversidad general del microbioma presente en esa muestra.

Sin embargo, las técnicas metagenómicas pueden proporcionar una comprensión más profunda de la población microbiana general presente en la muestra. La metagenómica se refiere a un análisis genético independiente del cultivo de los genomas presentes en un entorno o muestra específicos. Dado que cada organismo presente en la muestra tendrá un genoma específico, este enfoque puede proporcionar información sobre la composición y diversidad de toda la población y también puede proporcionar identidad taxonómica a "¿Quién está ahí?" dentro de esa muestra, y qué tan abundante es cada miembro en comparación con los demás. Para los propósitos de esta discusión, existen dos métodos de muestra completa, no enriquecidos e independientes del cultivo que logran esto: secuenciación metagenómica de escopeta y secuenciación 16S.

Antes de continuar, ofreceremos un rápido repaso sobre la taxonomía. Todos los organismos vivos se clasifican según características físicas, metabólicas y/o genómicas compartidas. Esta clasificación es parte de un sistema jerárquico escalonado que comienza en el rango y dominio más amplio y progresa en rango hasta reino, filo, clase, orden, familia, género y especie. Por ejemplo, Escherichia coli sería del género Escherichia y de la especie E. coli. Algunas bacterias se pueden clasificar además en subespecies y/o serotipos. El patógeno Salmonella Enteritidis se clasificaría como Salmonella (género) enterica (especie) subespecie enterica serotipo Enteritidis. La necesidad de identificar los rangos taxonómicos inferiores es un factor clave para determinar si se utiliza la secuenciación metagenómica de escopeta (más compleja) o la secuenciación 16S (menos compleja y más barata).

La secuenciación metagenómica de escopeta funciona esencialmente como su nombre lo indica. Implica la extracción de todo el ADN en una muestra de carne o ambiental, la fragmentación del ADN en trozos más pequeños (para secuenciación de lectura corta) y la secuenciación de ADN que puede ocurrir utilizando una plataforma de lectura corta o larga. La secuenciación proporciona un archivo FASTQ que contiene las llamadas "lecturas", que representan el código genético de cada fragmento de ADN de la muestra original. Este archivo FASTQ sirve como base para el proceso bioinformático, que consta de una serie de herramientas y pasos informáticos que, en conjunto, procesan las lecturas individuales (es decir, secuencias) en el archivo FASTQ. Esta canalización puede requerir un alto grado de potencia informática y almacenamiento de datos para analizar de manera eficiente los archivos FASTQ. El proceso bioinformático a menudo se personaliza, pero normalmente implica la eliminación de secuencias de baja calidad y del huésped (por ejemplo, ADN de Bos taurus en el caso de una muestra de carne molida), seguido del ensamblaje, alineación y/o anotación de las secuencias utilizando bases de datos genómicas existentes. Estos procesos bioinformáticos permiten la identificación y caracterización de secuencias de interés, como secuencias de bacterias que podrían estar involucradas en genes de deterioro o virulencia dentro de patógenos conocidos. La secuenciación directa puede proporcionar identificación taxonómica de la especie o incluso del nivel de cepa (si los datos son lo suficientemente grandes) y también puede proporcionar una visión más amplia de los genes presentes en la muestra. Esto puede resultar valioso para comprender la abundancia relativa de genes asociados con un rasgo como la resistencia a los antimicrobianos o factores de virulencia dentro de la muestra o el entorno.

El método conocido como secuenciación 16S es similar a la secuenciación de escopeta en el sentido de que implica la extracción del ADN total de la muestra. Sin embargo, la secuenciación de 16S implica la amplificación por PCR únicamente del gen 16S rRNA y la secuenciación de regiones hipervariables específicas dentro del gen 16S. El gen 16S rRNA es ubicuo en procariotas (bacterias y arqueas), pero las regiones hipervariables presentes dentro del gen 16S tienden a tener secuencias diferentes a nivel de familia o género y, a veces, a nivel de especie. De esta manera, las regiones hipervariables del gen 16S son como "huellas dactilares" de secuencia que pueden proporcionar la composición taxonómica de las bacterias presentes en la muestra. Dado que el enfoque 16S requiere la secuenciación sólo de las regiones muy pequeñas, específicas e hipervariables del gen 16S, generalmente es menos complejo y más barato de realizar que la secuenciación metagenómica de escopeta, que requiere la secuenciación de todo el ADN.

La Figura 2 muestra la abundancia relativa taxonómica de 16S separada por tipo de carne. Cada barra representa una muestra de carne individual, con diferentes colores dentro de la barra que designan un género único identificado dentro de los datos del microbioma. Desarrollar un gráfico como este puede ser útil al comparar la presencia de ciertos géneros dentro de una muestra entre dos tipos de carne, la carne versus la superficie de contacto, o al comparar diferentes puntos en el proceso de fabricación, como el biomapeo del establo a través del refrigerador de canales. Este gráfico refleja la abundancia relativa de 16S de dos tipos de carne diferentes (BJ y TL). Cada barra vertical representa una muestra individual tomada de BJ y TL. Este gráfico muestra que existe una alta variabilidad entre muestras en la composición del microbioma dentro de los dos tipos de carne y procesos de fabricación, incluso en muestras tomadas dentro de la misma planta de procesamiento. También muestra que una gran proporción del microbioma de la carne está formada por taxones de baja abundancia, que se muestran en amarillo; Estos taxones de baja abundancia representan cada uno de ellos <1 por ciento de todos los datos genómicos de la muestra.

Para los procesadores de carne y aves, la secuenciación 16S puede proporcionar información valiosa para comprender la ecología microbiana de la carne o el medio ambiente de una manera relativamente eficiente y rentable. Si bien un recuento de placas aeróbicas basado en cultivos puede dar una idea de la carga y la diversidad morfológica, la secuenciación 16S puede proporcionar una respuesta a la pregunta "¿Quién está ahí?" en el recuento en placa, incluidas las bacterias que pueden no ser cultivables o distinguibles con métodos de cultivo en placa. Es importante señalar que la secuenciación 16S es limitada porque no proporcionará identificación a nivel de especie o, a veces, incluso de género, para todas las bacterias identificadas en la muestra, y no puede distinguir entre géneros estrechamente relacionados. Tampoco informa qué genes o funciones están presentes dentro de los genomas bacterianos. Si bien la secuenciación metagenómica directa puede proporcionar información sobre especies y genes, esto conlleva un mayor costo y complejidad. En el diseño inicial del proyecto sería necesario evaluar una pregunta y un requisito específicos que justificarían la metagenómica de escopeta.

Existen varias aplicaciones en las que la secuenciación metagenómica puede ser una herramienta valiosa para los procesadores de carne y aves, especialmente cuando se utiliza en complemento con métodos tradicionales que dependen del cultivo. Una comprensión de la ecología microbiana del entorno vegetal puede proporcionar a los procesadores información para optimizar los esfuerzos de saneamiento, determinar el efecto de las intervenciones más allá de la prevalencia de patógenos y proporcionar información sobre cómo estos cambios pueden afectar la vida útil del producto cárnico terminado. Una vez más, la decisión de utilizar la secuenciación metagenómica 16S o la secuenciación metagenómica depende de la pregunta de investigación que se plantee y de si es necesario o no lograr la identificación de bacterias a nivel de especie y/o comprender el potencial fenotípico de los genes presentes en la secuencia. muestra.

La secuenciación Shotgun y el 16S pueden ayudar a proporcionar información sobre preguntas de investigación sobre el entorno vegetal, tales como:

Además, la secuenciación metagenómica puede ser una herramienta valiosa para comprender cómo cambia el microbioma del producto cárnico terminado a lo largo de la vida útil y para comprender cómo las contribuciones del entorno vegetal, las intervenciones o los antimicrobianos formulados pueden afectar la vida útil. Si bien muchos procesadores tienen un recuento máximo establecido de bacterias mesófilas o psicrotróficas que determina el final de la vida útil, no siempre es un indicador infalible del crecimiento de bacterias específicas que contribuyen a características de falla física como olores, sabores desagradables, o apariencia inaceptable del paquete. El uso de secuenciación 16S o de escopeta como complemento a los análisis dependientes del cultivo puede proporcionar información sobre cómo cambia la abundancia relativa general de ciertas bacterias dentro de la muestra a lo largo de su vida útil. Esto puede proporcionar a los procesadores la capacidad de abordar las bacterias específicas que influyen en la vida útil del producto, potencialmente mediante saneamiento o intervenciones en la planta de procesamiento o mediante la formulación de un sistema antimicrobiano que se dirija eficazmente al organismo en cuestión.

Es importante tener en cuenta que los resultados del 16S o del análisis de secuenciación de escopeta son de naturaleza composicional y proporcionarán una abundancia relativa de las bacterias presentes. Por ejemplo, el número total de lecturas (secuencias) que se originan en un determinado género bacteriano se sumaría para estimar la abundancia relativa de ese género en la muestra. Este número de abundancia relativa puede asociarse con el recuento real de ese género específico, pero este recuento no es un valor absoluto y, por lo tanto, no proporciona una medida directa de la carga de ese género en la muestra. Esta es también la razón por la que los métodos de recuento en placas no selectivos pueden ser un excelente complemento para un proyecto de investigación metagenómica, al proporcionar enumeración y dar un mejor contexto a las abundancias relativas calculadas a partir de los análisis metagenómicos.

Además, las medidas estadísticas de diversidad alfa (la diversidad dentro de una muestra) y diversidad beta (similitud/disimilitud comparadas entre muestras) se usan comúnmente para analizar y visualizar la diversidad y composición de las poblaciones microbianas dentro y entre muestras; Nuevamente, los enfoques basados ​​en cultivos pueden aumentar estos análisis y proporcionar más contexto sobre la ecología microbiana. Para aprovechar plenamente este tipo de conjuntos de datos, los procesadores deberán familiarizarse con estas medidas estadísticas mientras desarrollan la pregunta de investigación y la prueba.

Cada punto en la Figura 3 representa la diversidad beta de una sola muestra, comparando dos tipos de carne diferentes (representados por puntos rojos y azules) según los datos 16S de la muestra. Los puntos que están más juntos tienen una composición de microbioma más similar que los puntos que están más separados. En este gráfico, la agrupación entre muestras/puntos del mismo tipo de carne sugiere un microbioma general más similar dentro de cada uno de los tipos de carne. La visualización de la diversidad beta como esta se puede utilizar para comparar la similitud del microbioma entre dos tipos de carne, entre la superficie de la carcasa antes y después de la aplicación de una intervención superficial, entre la carne y las superficies de contacto, entre dos plantas que elaboran el mismo producto. (con una vida útil fallida), o entre un producto formulado con y sin un determinado antimicrobiano. Estos gráficos son una forma conveniente de comprender los cambios o diferencias en las poblaciones microbianas de diferentes tipos de muestras o los mismos tipos de muestras sometidas a diferentes intervenciones o condiciones ambientales.

En la Figura 4, los puntos de diferentes colores reflejan géneros que son significativamente más abundantes entre los tipos de carne analizados. El tamaño del punto refleja la prevalencia general de cada género clave observado en el estudio, y el Log(Coeficiente) (eje x) refleja la magnitud de la diferencia, en este caso entre dos tipos de carne diferentes. La abundancia diferencial puede ser útil para comprender qué géneros bacterianos pueden estar impulsando la vida útil general de un producto cárnico; si la presencia de bacterias clave puede cambiar a lo largo de un turno de producción; o si la presencia de bacterias clave puede estar asociada con un tipo de carne, un proceso de fabricación o la presencia de un patógeno en particular.

La evolución de la secuenciación de próxima generación ha reducido sustancialmente el coste de realizar un estudio de investigación basado en la genómica. Se encuentran disponibles puntos de entrada relativamente asequibles para plataformas de secuenciación. Sin embargo, poseer un secuenciador es sólo un punto de partida para poder realizar un estudio genómico. Si bien el análisis se basa en el ADN, la capacidad exitosa de procesar la muestra, extraer el ADN y proporcionar la muestra al secuenciador aún depende de los técnicos de laboratorio, que deben ser competentes en técnicas moleculares, incluidas las técnicas de mejores prácticas que minimicen la contaminación. y sesgos que pueden afectar los resultados. Además, el análisis genómico requiere amplias capacidades computacionales, almacenamiento de datos y también puede requerir la contratación de personal adicional con experiencia en bioinformática y análisis de microbiomas, específicamente. Por estas razones, puede resultar difícil para la mayoría de los procesadores de carne desarrollar estas capacidades internamente y poder justificar los costos iniciales de puesta en marcha, a menos que se determine una necesidad de investigación definitiva y continua.

Sin embargo, existen oportunidades para asociarse con laboratorios de terceros o investigadores universitarios para realizar investigaciones metagenómicas tanto exploratorias como basadas en hipótesis en la planta. Estos laboratorios ya cuentan con la experiencia y el hardware necesarios para realizar la extracción, secuenciación, bioinformática y análisis de datos. Como es el caso con cualquier proyecto de investigación, la pregunta de investigación general, el diseño de la prueba y las funciones del procesador de carne y del laboratorio externo/universidad deben definirse y comprenderse claramente antes de iniciar el proyecto.

A medida que el costo de la secuenciación siga disminuyendo, se determinarán más aplicaciones para su uso y se superarán las barreras financieras y computacionales. Los métodos independientes del cultivo ciertamente tienen un lugar en la caja de herramientas para que los procesadores comprendan el entorno de la planta, la carne y la vida útil del producto terminado en situaciones donde los análisis dependientes del cultivo pueden ser limitados. La investigación y el desarrollo adicionales de secuenciación de lectura larga y enriquecida con objetivos también pueden proporcionar una vía para diagnósticos independientes del cultivo que puedan identificar la presencia y secuencia de patógenos de bajo nivel en una muestra de carne o ambiental. Existe la posibilidad de que estas técnicas se utilicen con mayor regularidad, especialmente a medida que los debates sobre la seguridad alimentaria comiencen a pasar de la prevalencia general a la carga y, luego, potencialmente, a los genes presentes.

Como ocurre con cualquier herramienta, la utilidad de la misma suele estar determinada por el trabajo que se le pide que realice. Los bisturíes pueden ser útiles cuando el trabajo requiere detalles finos, pero nadie va a usar un bisturí para talar un árbol. Como tal, la metagenómica de escopeta y la secuenciación 16S pueden ser herramientas muy útiles cuando surge la necesidad. Los procesadores de carnes y aves deben familiarizarse con las capacidades de cada uno y evaluar las aplicaciones potenciales de su uso para comprender mejor la ecología microbiana de sus plantas de procesamiento, o como complemento a sus programas actuales de monitoreo ambiental o vida útil.

Aaron Asmus, M.Sc. , es el Director de Servicios de Laboratorio y Desarrollo de Productos de Alimentos Refrigerados en Hormel Foods Corporation en Austin, Minnesota. También es Ph.D. candidato de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Minnesota en St. Paul, Minnesota.

Noelle Noyes, Ph.D., DVM, es profesor asistente en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Minnesota en St. Paul, Minnesota.

Noelle Noyes, Ph.D., DVM, es profesora asistente en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Minnesota en St. Paul, Minnesota.

Aaron Asmus, M.Sc., es Director de Servicios de Laboratorio y Desarrollo de Productos de Alimentos Refrigerados en Hormel Foods Corporation en Austin, Minnesota. También es Ph.D. candidato de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Minnesota en St. Paul, Minnesota.