Alérgeno

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 763 (2023) Citar este artículo

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El informe actual describe una vía mecanicista gradual de las respuestas inmunes reguladas por NLRP3/caspasa1/IL-18 operativas en la esofagitis eosinofílica (EoE). Mostramos que las células epiteliales esofágicas y la IL-18 regulada por NLRP3 derivada de macrófagos inician la enfermedad y la IL-5 inducida facilita el crecimiento y la supervivencia de los eosinófilos. También encontramos que los ratones IL-18-/- expuestos a A. fumigatus o los ratones neutralizados con IL-18 están protegidos de la inducción de EoE. Lo más importante es que presentamos que la administración intravascular de rIL-18 a ratones ΔdblGATA y ratones CD2-IL-5 muestra el desarrollo de características de EoE como eosinófilos degranulados e intraepiteliales, hiperplasia de células basales, remodelación y fibrosis. De manera similar, mostramos que una vía de IL-18 regulada por NLRP3-caspasa1 inducida también está operativa en la EoE humana. Por último, presentamos la evidencia de que los inhibidores de NLRP3 y caspasa-1 (MCC950, BHB y VX-765) protegen la patogénesis de la EoE inducida por A. fumigatus y extracto de maíz. En conclusión, el estudio actual proporciona una nueva comprensión al implicar la vía de IL-18 regulada por NLRP3/caspasa1 en la patogénesis de la EoE. El estudio tiene importancia clínica y una nueva estrategia terapéutica, que agota solo los eosinófilos patógenos que responden a IL-18, no los eosinófilos ingenuos generados por IL-5, fundamentales para mantener la inmunidad innata.

La eosinofilia esofágica se observa comúnmente en diversos problemas gastrointestinales, incluida la esofagitis eosinofílica (EoE)1,2, una enfermedad con una incidencia cada vez mayor en todo el mundo3,4. Los rasgos endoscópicos característicos observados en pacientes con EEo incluyen surcos, anillos (esófago corrugado) y remodelación tisular extensa5,6,7. La EEo y las enfermedades por reflujo gastroesofágico (ERGE) son trastornos esofágicos estrechamente relacionados que anteriormente se diferenciaban por la capacidad de respuesta de los inhibidores de la bomba de protones (IBP) (>15 pautas informadas de eosinofilia esofágica/fp)8; sin embargo, las últimas directrices de la Evaluación de Directrices para la Investigación y Evaluación (AGREE) II omiten este criterio9. La evidencia sugiere que las respuestas inflamatorias causadas por alérgenos ambientales o alimentarios son clave para el desarrollo de la EEo10,11,12. En los últimos años, los factores genéticos también se han asociado con la promoción de la patogénesis de la EEo13,14. La inducción de citoquinas inducidas por alérgenos como IL-5, IL-13, IL-18 e IL-33 está implicada en la patogénesis de la EoE2,15,16,17; sin embargo, los ensayos clínicos que prueban varios neutralizadores de citocinas, incluidos anti-IL-5, anti-IL-13 y anti-IL-4R, aún no han proporcionado resultados satisfactorios para mejorar la EEo.

La IL-18 es un factor inductor de IFN-γ y un miembro de la familia de citocinas IL-1, que tiene una amplia gama de funciones relacionadas con enfermedades inflamatorias y alérgicas15. En trabajos anteriores, establecimos que la IL-18 puede generar un subconjunto de eosinófilos patógenos expresados ​​en CD274 independiente de IL-5 y transformar eosinófilos vírgenes generados por IL-5 en eosinófilos patógenos CD274+17,18. La IL-18 es producida por células presentadoras de antígenos y células epiteliales mediante la activación de la vía del inflamasoma NLRP3 (proteína receptora tipo NOD-3)/caspse-119. La activación de NLRP3 también está implicada en respuestas inflamatorias en enfermedades alérgicas, incluido el asma y varios trastornos gastrointestinales20. Recientemente encontramos evidencia del papel de la IL-18 en la promoción de la patogénesis del asma eosinofílica18 y observamos la IL-18 inducida en sangre y el ARNm de IL-18R en biopsias de pacientes con EEo15. Se ha informado que varios inhibidores del inflamasoma NLRP3 previenen la destrucción de tejido en enfermedades alérgicas relacionadas con NLRP3 en modelos experimentales21, y nuestros datos actuales proporcionan evidencia de que NLRP3 y caspasa-1 son objetivos terapéuticos potenciales para la EEo. Inhibidores de NLRP3 como N-[[(1,2,3,5,6,7-hexahidro-s-indacen-4-il)amino]carbonil]-4-(1-hidroxi-1-metiletil)-2-furansulfonamida (MCC950), β-hidroxibutirato (BHB) y el inhibidor de caspasa1 Belnacasan (VX-765) son los inhibidores más selectivos y mejor caracterizados disponibles actualmente y se han evaluado en una amplia variedad de trastornos inflamatorios activados por NLRP3. En un modelo de ratón, MCC950 y BHB han mostrado una importante promesa terapéutica para el tratamiento de la inflamación y la fibrosis22,23. En consecuencia, centramos nuestros estudios actuales en comprender el mecanismo gradual subyacente a la inducción de la patogénesis de la EoE mediada por IL-18 regulada por NLRP3-caspasa1. En este estudio, mostramos que los ratones expuestos a aeroalérgenos (Aspergillus) o alérgenos alimentarios (maíz) desarrollan la inducción y activación de NLRP3 y caspasa-1 en macrófagos esofágicos y células epiteliales acumuladas. Estas células son la fuente de NLRP3 y de IL-18 regulada por caspasa1, que inducen la inflamación eosinofílica esofágica y la patogénesis de la EEo. También observamos una inducción similar de IL-18 regulada por NLRP3/caspasa1 que induce inflamación eosinofílica en ratones y una vía mecanicista similar está operativa en la EoE humana. Presentamos evidencia de que el tratamiento con inhibidores de NLRP3 y caspasa1 y neutralización de IL-18 protege contra la patogénesis de EEo inducida por alérgenos en un modelo murino de EEo, lo que proporciona evidencia de una estrategia de tratamiento alternativa a la inmunoterapia de neutralización de citoquinas Th2 para EEo2,16,24. Es de destacar que la terapia anti-IL-5 (mepolizumab o Dupixent) reduce los eosinófilos en sangre pero no mejora ni previene satisfactoriamente la EEo25,26. Más recientemente, la FDA aprobó Dupixent (anti-IL-4Rα) 300 mg semanales como tratamiento para la EE humana en un ensayo limitado de fase 3, aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo. Los datos iniciales muestran que 300 mg de Dupixent semanalmente son marginalmente efectivos y seguros para pacientes de 12 años o más, pero mostraron solo una reducción del 69 y el 64 % en los síntomas de EEo con respecto al valor inicial en comparación con el 32 y el 41 % para el placebo. El criterio de valoración es solo una mejora del 30% con Dupixent en comparación con placebo27 y aún no está claro qué otros síntomas mejoraron en pacientes con EEo con el tratamiento con Dupixent. La IL-5 sirve como factor de crecimiento y supervivencia de los eosinófilos y regula la IL-13 que se une a la IL-4Rα. Los datos presentados indican que la vía de IL-18 regulada por NLRP3/caspasa1 inducida por alérgenos inicia la enfermedad, no las citoquinas Th2 IL-5 o IL-13 o eotaxina-3. Además, estos hallazgos respaldan informes anteriores de que los ratones con deficiencia de doble gen CD4, CD8, STAT6, IL-13, eotaxina e IL-13/IL-4 no están protegidos de la EoE28 inducida por alérgenos. Estos informes indican que las células epiteliales derivadas de IL-18 son suficientes para generar, transformar y acumular eosinófilos patógenos en la mucosa epitelial esofágica. Por lo tanto, con base en estos nuevos hallazgos, proponemos varios enfoques para mejorar la patogénesis de la EoE humana al proponer realizar un ensayo clínico de neutralización de IL-18 y también inhibir NLRP3, caspasa1 utilizando el antagonista respectivo. Lo más importante es que el ensayo propuesto agotará solo los eosinófilos patógenos CD274+ generados o transformados con IL-18.

Se ha informado de IL-18 inducida en EoE15 humana; sin embargo, aún no se comprenden los mecanismos subyacentes a la patogénesis de la EEo inducida por IL-18. La IL-18 está regulada por la vía del inflamasoma NLRP3/caspasa-1. Primero examinamos la expresión de NLRP3 en secciones de tejido esofágico de un modelo murino de EoE experimental inducido por aeroalérgenos (Aspergillus fumigatus). Los ratones fueron desafiados con A. fumigatus (100 µg) según el protocolo establecido2 y se muestra esquemáticamente (Fig. S1a; creado con BioRender.com). Realizamos tinción de inmunofluorescencia anti-NLRP3 y anti-F4/80 en secciones de tejido esofágico para identificar la fuente de IL-18 regulada por NLRP3 en EEo y encontramos expresión inducida de anti-NLRP3 (verde) en células epiteliales y anti-NLRP3+anti. -F4/80 (rojo) en macrófagos en ratones desafiados con A. fumigatus (Fig. 1a, i – ii). Luego realizamos tinción de inmunofluorescencia doble anti-NLRP3 (verde) y anti-IL-18 (rojo), que detectó colocalización de la expresión de anti-NLRP3 y anti-IL-18 (amarillo) en células epiteliales y macrófagos de la lámina propia acumulados en el esófago. secciones de tejido de ratones desafiados con A. fumigatus (Fig. 1b, i – ii). El análisis de cuantificación morfométrica mostró células positivas para NLRP3 y F4/80 significativamente mayores (Fig. 1a, iii) y células positivas para IL-18 (Fig. 1b, iii) en ratones expuestos a A. fumigatus en comparación con ratones expuestos a solución salina. Estos datos indican que tanto los macrófagos como las células epiteliales son fuentes de IL-18 regulada por NLRP3 en la EoE. Además, realizamos inmunotinción tisular anti-MBP para detectar eosinofilia esofágica, incluidos eosinófilos intraepiteliales (Fig. 1c, i-ii). El análisis de cuantificación morfométrica mostró eosinófilos esofágicos mediados por IL-18 regulados por NLRP3 inducidos significativamente en ratones desafiados con A. fumigatus (Fig. 1c, iii). La inmunotinción anti-Ki-67 de secciones de tejido esofágico indicó una mayor proliferación y cuantificación de células epiteliales en ratones expuestos a A. fumigatus en comparación con ratones expuestos a solución salina (Fig. 1d, i-iii). Validamos la inducción de NLRP3 total y activado, caspasa1, IL-18 y la proteína granular eosinófila EPX en el esófago mediante la realización de análisis de transferencia Western en ratones desafiados con solución salina y A. fumigatus (Fig. 1e). NLRP3 se detecta como una isoforma diferente mediante transferencia Western y la banda de proteína de 120 kda es el tamaño real y las otras bandas son sus isoformas. Además, establecer que la inmunotinción tisular detectada NLRP3 e IL-18 en células epiteliales y macrófagos no son un artefacto. Por lo tanto, también aislamos células epiteliales esofágicas inflamadas y macrófagos de ratones expuestos a A. fumigatus y realizamos análisis de transferencia Western para examinar NLRP3, Caspasa1 e IL-18. El análisis de densitometría y transferencia Western mostró que las células epiteliales eran de hecho la fuente de NLRP3, IL-18, IL-1β y proteínas granulares eosinófilas inducidas, en comparación con los macrófagos que mostraron NLRP3 y caspasa1 en su mayoría comparables en ratones expuestos a A. fumigatus en comparación con los expuestos a solución salina. células aisladas (Fig. 1f, g). Las dos isoformas diferentes de NLRP3 se detectan entre 110 y 120 kda. La variante de longitud completa y una variante que carece del exón 5. Algunos anticuerpos detectan ambas formas de isoformas y otros no. Las características funcionales de ambas isoformas no se conocen bien. El NLRP3 completo correcto se detecta en 120 kda. Además, la activación (pNLRP3) es el evento de preparación esencial que desencadena una respuesta inmune mediante la activación de la caspasa 1 para inducir citoquinas inflamatorias como IL-1β e IL-18. Sin la detección de NLRP3 fosforilado (pNLRP3), es difícil concluir que la regulación inmune regulada por NLRP3 esté operando para inducir el proceso de inflamación. Por lo tanto, el pNLRP3 es un evento de preparación esencial para la activación del inflamasoma que desencadena una respuesta inmune a través de la caspasa 1 para inducir IL-18 (Fig. 1f). Una alta expresión de transcripción similar de F4/80, IL-18 e IL-5 e IL-13 que responden a eosinófilos en EoE experimental inducida por A. fumigatus (Fig. 1h). La transcripción inducida de IL-5 e IL-13 indica su papel en la EEo, pero posiblemente en el crecimiento, la supervivencia y la progresión de la patogénesis de la enfermedad de los eosinófilos. Además, también presentamos fotomicrografías representativas de inmunofluorescencia detalladas de la expresión individual de anti-NLRP3, anti-F4/80 y anti-IL-18 para ratones expuestos a solución salina (Fig. S1b, c, i-iv) y A. fumigatus. ratones (Fig. S1d, e, i – iv). Acumulación de colágeno y células anti-TGF-β + de citoquinas profibróticas en las secciones de tejido esofágico de ratones expuestos a A. fumigatus en comparación con ratones expuestos a solución salina con un aumento cuantitativo significativo (Fig. S1f, g, i-iii).

Una fotomicrografía representativa del análisis de inmunofluorescencia doble muestra NLRP3 inducido en células epiteliales esofágicas y macrófagos F4/80+, y células NLRP3+ e IL-18+ doblemente positivas colocalizadas en secciones de tejido esofágico de ratones expuestos a A. fumigatus en comparación con ratones expuestos a solución salina ( a, b, i-ii). Los análisis de cuantificación morfométrica indicaron números significativamente mayores de células anti-F4/80+, anti-NLRP3+ y anti-IL-18+ en ratones expuestos a A. fumigatus en comparación con ratones expuestos a solución salina (a, b, iii). La inmunotinción anti-MBP detectó una alta acumulación de eosinófilos en ratones expuestos a A. fumigatus, pero pocos o ningún eosinófilos en ratones expuestos a solución salina (c, i-ii). El análisis de cuantificación morfométrica mostró células MBP+ significativamente inducidas en ratones expuestos a A. fumigatus, expresadas como eosinófilos/hpf (c, iii). La proliferación de células epiteliales se muestra mediante inmunotinción de las secciones de tejido con anticuerpo anti-Ki-67 en ratones expuestos a A. fumigatus en comparación con ratones expuestos a solución salina (d, i–ii), y células Ki-67+ expresadas como células/mm2 (d ,iii). Análisis de transferencia Western para la detección inducida de NLRP3, p-NLRP3, caspasa1 pro y madura, IL-18 activa e inactiva y EPX en el esófago de ratones expuestos a A. fumigatus o solución salina (e). Análisis de densitometría y transferencia Western para confirmar que las células epiteliales y los macrófagos son la fuente de IL-18, caspasa, IL-18, IL-1β y EPX reguladas por NLRP-3 de células epiteliales y macrófagos aislados con esófago inflamado de ratones desafiados con solución salina y A. fumigatus. se analizan y muestran (f, g). Expresión relativa de ARNm de NLRP3, F4/80, IL-18, IL-5 e IL-13 medida mediante análisis de RT-PCR (h). Los datos se expresan como media ± DE, n = 6–8 ratones/grupo. *p < 0,05; **p<0,001; ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Las fotomicrografías presentadas tienen un aumento original de ×400 (barra de escala de 20 µm). Epitelio EP, lámina propia LP, mucosa muscular MS, luz LU.

Además, también examinamos que la vía de señalización de IL-18 regulada por NLRP3 también es operativa para promover la patogénesis de EEo inducida por alérgenos alimentarios. En consecuencia, sensibilizamos a los ratones con 1 mg de alumbre y 200 µg de extracto de maíz por vía intraperitoneal y luego los desafiamos tres veces por vía intranasal con extracto de maíz (100 µg) según el protocolo establecido29 (Fig. S2a; creado con BioRender.com). Elegimos la vía intranasal porque descubrimos que es más eficaz para promover la EE en ratones que la inoculación a través del esófago. Anteriormente demostramos que el esófago y la tráquea están conectados a través de ganglios linfáticos locales que acumulan eosinófilos y se dirigen al esófago29. Tanto los ratones expuestos a A. fumigatus como los sensibilizados con extracto de maíz/expuestos con maíz mostraron NLRP3 e IL-18 inducidos en macrófagos y células epiteliales F4/80+ después de la inmunotinción con anticuerpos respectiva de secciones de tejido esofágico en comparación con los ratones sensibilizados con extracto de maíz/expuestos con solución salina. ratones (Fig. 2a, b, i – ii). El análisis de cuantificación morfométrica mostró recuentos de células NLRP3+ F4/80+ y NLRP3+ IL-18+ significativamente mayores en secciones de tejido esofágico de ratones sensibilizados con maíz/desafiados con maíz en comparación con ratones sensibilizados con maíz/desafiados con solución salina (Fig. 2a, b, iii ). La inmunotinción Anti-MBP reveló eosinofilia esofágica en ratones sensibilizados con maíz/desafiados con maíz, incluida la infiltración de eosinófilos en la capa epitelial (Fig. 2c, i-ii) y la cuantificación detectó un número significativamente inducido de células anti-MBP+ (Fig. 2c,iii). De manera similar, también observamos células epiteliales proliferativas expresadas anti-Ki-67 inducidas que mostraron células Ki-67 + inducidas significativamente en las secciones de tejido de ratones sensibilizados con maíz / desafiados con solución salina (Fig. 2d, i-iii) en alumbre de maíz. ratones sensibilizados/desafiados con maíz en comparación con ratones sensibilizados con alumbre de maíz/desafiados con solución salina. También realizamos análisis de densitometría y transferencia Western en las células epiteliales aisladas y los macrófagos acumulados del esófago inflamado de ratones sensibilizados/desafiados con maíz para confirmar la inducción de NLRP3, Caspasa1, IL-18, IL-1β y la proteína granular eosinófila EPX. El análisis mostró que las células epiteliales, de hecho, son la fuente de IL-18 madura inducida por NLRP3 y proteínas granulares eosinófilas, en comparación con los macrófagos que mostraron NLRP3 y caspasa1 en su mayoría comparables en ratones sensibilizados con maíz y desafiados con maíz (Fig. 2e, f). Se muestra un análisis detallado de inmunofluorescencia de anti-NlRP3, anti-F4/80, anti-NLRP3 y anti-IL-18 de secciones de tejido esofágico de ratones sensibilizados con maíz/desafiados con maíz y de ratones sensibilizados con maíz/desafiados con solución salina (Fig. S2b-e). Además de demostrar que la IL-18 induce directamente la patogénesis de la EoE, también realizamos un análisis de transferencia Western en macrófagos y células epiteliales esofágicas aisladas expuestas a rIL-18 de ratones no expuestos. El análisis indicó que rIL-18 trató ambos tipos de células que inducen citocinas inflamatorias sin inducir NLRP3 y caspasa1 (Fig. S2f).

Una fotomicrografía representativa de la tinción por inmunofluorescencia de células NLRP3+/F4/80+ y NLRP3+/IL-18+ en tejido esofágico de ratones sensibilizados con alumbre de maíz y expuestos a extracto de maíz y solución salina y NLRP3+/F4/80+ y NLRP3+/IL-18. + Se muestra la cuantificación morfométrica de las células (a, b, i-iii). La inmunotinción anti-MBP detectó acumulación de eosinófilos MBP+ en secciones esofágicas de ratones sensibilizados con alumbre de maíz expuestos a extracto de maíz o solución salina con cuantificación morfométrica (c, i-iii). Hiperplasia de células epiteliales Ki-67+ y cuantificación de células Ki-67+ con cuantificación morfométrica en ratones sensibilizados con alumbre de maíz desafiados con maíz (d, iii) y solución salina (d, i-ii). Análisis de densitometría y transferencia Western para confirmar que las células epiteliales y los macrófagos son la fuente de IL-18, caspasa, IL-18 y EPX reguladas por NLRP-3 de ratones sensibilizados con solución salina y desafiados con maíz con esófago inflamado. Se analizan células epiteliales y macrófagos aislados y mostrado (e,f). Los datos se expresan como media ± DE, n = 6–8 ratones/grupo. *p < 0,05; **p<0,001; ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Las fotomicrografías presentadas tienen un aumento original de ×400 (barra de escala de 20 µm). Epitelio EP, lámina propia LP, mucosa muscular MS, luz LU.

Dado que tanto los macrófagos acumulados como las células epiteliales inducen IL-18 regulada por NLRP3; Primero probamos la hipótesis de que la sobreexpresión de IL-18 in vivo estimula a los precursores de eosinófilos para desarrollar eosinófilos y proporcionar EEo en ratones. Inyectamos cinco dosis de 10 µg de rIL-18 más 100 µl de solución salina o solo 100 µl de solución salina por vía intravenosa en ratones de tipo salvaje y con deficiencia de GATA1 (ΔdblGATA) en días alternos durante 10 días. Elegimos la vía intravenosa porque los ratones ΔdblGATA tienen deficiencia de eosinófilos tisulares pero tienen precursores de eosinófilos en la médula ósea18. Los ratones tratados con rIL-18 desarrollaron eosinofilia esofágica en comparación con pocos o ningún eosinófilo en los ratones tratados con solución salina (Fig. 3a, i). Los ratones ΔdblGATA tratados con rIL-18 mostraron varias características de EEo, incluidos eosinófilos intraepiteliales (Fig. 3a, ii), proliferación de células epiteliales Ki-67 + (Fig. 3b, i – ii) y acumulación de colágeno en secciones de tejido esofágico ( Figura 3c, i-ii). La cuantificación morfométrica de MBP +, Ki-67 + y colágeno mostró una inducción significativa en ratones ΔdblGATA tratados con rIL-18 en comparación con ratones ΔdblGATA tratados con solución salina (Fig. 3a-c, iii). Además, también realizamos un análisis de transferencia Western del extracto esofágico de solución salina y rIL-18 administrados a ratones CD2-IL5 y ΔdblGATA, que mostraron expresión inicial de NLRP3 en ratones CD2-IL-5 pero no en ratones GATA1 y ninguna expresión de Caspasa1 en ambos estos ratones. Esto puede deberse a la presencia de eosinófilos en ratones CD2-IL-5 expuestos a solución salina, lo que indica que la vía NLRP3 está operativa. Sin embargo, después del tratamiento con rIL-18 en ratones GATA1 se mostró IL-18 inducida y proteína granular de eosinófilos EPX y citocina profibrótica TGF-β que confirma que rIL-18 tiene una respuesta directa en la promoción de la patogénesis de EEo en ratones GATA1 (Fig. 3e).

Una microfotografía representativa de secciones de esófago inmunoteñidas con anti-MBP muestra la acumulación de eosinófilos MBP+ en las secciones de tejido de ratones ΔdblGATA tratados con rIL-18 en comparación con ratones ΔdblGATA tratados con solución salina con cuantificación morfométrica (a, i – iii). Células epiteliales proliferantes anti-Ki-67+ en ratones ΔdblGATA tratados con solución salina y rIL-18 con cuantificación morfométrica (b, i-iii). La tinción con tricrómico de Masson muestra acumulación de colágeno en ratones ΔdblGATA tratados con rIL18 en comparación con ratones ΔdblGATA tratados con solución salina con cuantificación morfométrica (c, i-iii). Acumulación altamente inducida de eosinófilos MBP+ intraepiteliales con gránulos de MBP+ extracelulares detectada en ratones CD2-IL-5 tratados con rIL-18 en comparación con eosinófilos principalmente de lámina propia en ratones CD2-IL-5 tratados con solución salina con cuantificación morfométrica (d, i-iii) . El análisis de transferencia Western del extracto esofágico de ratones tratados con rIL-18 detectó rIL-18 pero no indujo NLRP3 o Caspasa1, pero indujo TGF-β (e). Los datos se expresan como media ± DE, n = 6–8 ratones/grupo. *p < 0,05; **p<0,001; ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Las fotomicrografías presentadas tienen un aumento original de ×400 (barra de escala de 20 µm). Epitelio EP, lámina propia LP, mucosa muscular MS, luz LU.

Anteriormente, también informamos in vitro que la IL-18 transforma eosinófilos vírgenes en eosinófilos patógenos17. Por lo tanto, para establecer que rIL-18 de hecho transforma in vivo la IL-5 generó eosinófilos vírgenes en eosinófilos patógenos; por lo tanto, utilizamos ratones CD2-IL-5 que no tienen eosinofilia intraepitelial ni eosinófilos degranulados. Tanto eosinófilos intraepiteliales como eosinófilos degranulados, que es la característica de la EoE16. Por lo tanto, tratamos ratones CD2-IL-5 con 10 µg de rIL-18 más 100 µl de solución salina o 100 µl de solución salina sola por vía intravenosa cinco veces en días alternos durante 10 días y examinamos la acumulación de eosinófilos en el esófago de los ratones. La inmunotinción anti-MBP de secciones de tejido esofágico mostró muchas eosinofilia intraepitelial y gránulos eosinofílicos extracelulares después de la desgranulación en ratones CD2-IL-5 inyectados con rIL-18 en comparación con ratones CD2-IL-5 expuestos a solución salina que mostraron principalmente eosinófilos en la lámina propia (Fig. .3d, i–ii). Estos datos confirman nuestra observación in vitro previa17 con respecto a la transformación in vivo de eosinófilos vírgenes generados por IL-5 en eosinófilos patógenos. La cuantificación morfométrica de las células MBP+ mostró un aumento significativo en los eosinófilos esofágicos en ratones CD2-IL-5 tratados con rIL-18 en comparación con ratones CD2-IL-5 expuestos a solución salina (Fig. 3d, iii). Además, se detecta un número comparable de eosinófilos en las secciones esofágicas de rIL-18 a los que se les administró ratones CD2-IL-5 y rIL-18 a los que se les administró ΔdblGATA mediante análisis de inmunotinción anti-EPX, pero el análisis de transferencia Western indicó un EPX esofágico altamente inducido en Los ratones que recibieron IL-18 CD2-IL-5 se comparan con los ratones ΔdblGATA (Fig. 3e).

A continuación, para establecer un papel crítico de la IL-18 en la patogénesis de la EEo, examinamos ratones de tipo salvaje y con IL-18-/- después de la inducción de la EEo experimental inducida por A. fumigatus. Las secciones de tejido esofágico se inmunotiñeron con anticuerpos anti-MBP. Observamos una gran cantidad de acumulación de eosinófilos MBP + en las secciones de tejido esofágico de ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus, pero solo se detectaron unos pocos en ratones IL-18 -/- y en ratones desafiados con solución salina (Fig. 4a, b, i-ii). La cuantificación morfométrica de eosinófilos MBP+ reveló una acumulación significativamente reducida de eosinófilos anti-MBP+ en ratones IL-18 -/- desafiados con A. fumigatus en comparación con ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus (Fig. 4c). También examinamos las células epiteliales proliferantes anti-Ki-67+ después de la inmunotinción para anti-Ki-67 (Fig. 4d, e, i-ii) que indicó que el número de células Ki-67+ disminuye significativamente en las secciones de tejido esofágico de A. Los ratones expuestos a fumigatus se comparan con los ratones IL-18-/- expuestos a Aspergillus, tanto los ratones IL-18-/- expuestos a solución salina como los ratones de tipo salvaje muestran eosinófilos basales comparables (Fig. 4f). Además, se observó una observación similar para la inmunotinción profibrótica anti-TGF-β y la cuantificación de células TGF-β+ indicó un número significativamente menor en las secciones de tejido esofágico de ratones IL-18-/- desafiados con A. fumigatus en comparación con ratones salvajes. ratones tipo (Fig. 4g, h, i – ii; 4i). Una acumulación reducida de colágeno similar después del análisis de tinción con tricrómico de Masson en ratones IL-18 -/- desafiados con A. fumigatus en comparación con ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus (Fig. 4j, k, i – ii). El espesor del tejido de colágeno depositado, medido mediante análisis cuantitativo morfométrico, indicó una acumulación de colágeno significativamente reducida en el esófago de ratones IL-18 -/- desafiados con A. fumigatus en comparación con ratones de tipo salvaje (Fig. 4l). Además, también analizamos los niveles de transcripción de la citoquina Th1 IL-18, el receptor de macrófagos F4/80, el inflamasoma NLRP3 y los niveles de transcripción de la citocina Th2 IL-4, IL-5, IL-13. Se encontró que los niveles de transcripción de todas las moléculas examinadas disminuyeron significativamente en ratones IL-18-/- desafiados con A. fumigatus en comparación con ratones de tipo salvaje (Fig. S3).

Una fotomicrografía representativa de secciones de tejido esofágico inmunoensayadas con anti-MBP muestra la acumulación de eosinófilos MBP+ en solución salina o en ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus (a, i-ii) y ratones IL-18-/- (b, i-ii) . El análisis morfométrico mostró eosinófilos significativamente reducidos en ratones IL-18-/- desafiados con A. fumigatus en comparación con ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus (c). Una fotomicrografía representativa de secciones de tejido esofágico inmunoensayadas con anti-Ki67 con análisis morfométrico muestra la proliferación de células epiteliales esofágicas Ki-67+ en solución salina o en ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus (d, i–ii) e IL-18-/- ratones (e, i – ii) y cuantificación de células Ki-67 + (f). Una microfotografía representativa de una sección de tejido esofágico inmunoensayado con anti-TGF-β y cuantificaciones con análisis morfométrico muestra células TGF-β+ en solución salina o ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus (g, i–ii) e IL-18−/ − ratones (h, i–ii) y cuantificación de células TGF-β+ (i). Una fotomicrografía representativa de la sección de tejido esofágico con tinción tricrómica de Masson y la cuantificación de colágeno con análisis morfométrico muestra la acumulación de colágeno en solución salina o en ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus (j, i-ii) y ratones IL-18-/- (k, i –ii) y cuantificación morfométrica de la acumulación de colágeno (área de espesor/mm2) (l). Todos los análisis de cuantificación morfométrica inmunoensayados se expresan como células/mm2, y el colágeno se expresa como área de espesor en µm2. Cuantificación morfométrica de células MBP+, Ki-67+ TGF-β+ en (células/mm2) y acumulación de colágeno (área de espesor/mm2) en ratones tratados con anti-rIL-18 neutralizados o tratados con IgG de isotipo coincidente no neutralizados ratones después del desafío de A. fumigatus (m, n). Los datos se expresan como media ± DE, n = 6–8 ratones/grupo. *p < 0,05; **p<0,001; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Las fotomicrografías presentadas tienen un aumento original de ×400 (barra de escala de 20 µm). Epitelio EP, lámina propia LP, mucosa muscular MS, luz LU.

Además, debido a que observamos que los ratones IL-18-/- están protegidos de la EoE experimental inducida por A. fumigatus, quisimos descartar además la posibilidad de que la protección de la EoE inducida por alérgenos encontrada en la IL-18-/- de todo el cuerpo sea no un artefacto. Realizamos un tratamiento de neutralización anti-IL-18 en ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus y encontramos una acumulación de eosinófilos significativamente reducida (Fig. 4m), proliferación de células epiteliales Ki-67+ (Fig. 4m), TGF-β+ células (Fig. 4m) y acumulación de colágeno (Fig. 4n) en ratones neutralizados con anti-IL-18 en comparación con ratones tratados con IgG de isotipo coincidente. Se muestran fotomicrografías representativas de acumulación de colágeno, anti-MBP, anti-Ki-67, anti-TGF-β y (Fig. S4).

Varios informes indican que los macrófagos maduros son la principal fuente de activación de NLRP3 que induce IL-18, por lo que probamos la hipótesis de que la deficiencia de macrófagos maduros previene la patogénesis de EoE mediada por IL-18 asociada a la activación de NLRP3. Por lo tanto, primero examinamos la expresión de NLRP3 e IL-18 después de un análisis de inmunofluorescencia doble anti-F4/80 y anti-NLRP3 en ratones de tipo salvaje y GM-CSF-/- desafiados con solución salina y A. fumigatus. El análisis detectó que los ratones de tipo salvaje desafiados por A. fumigatus tienen expresión de NLRP3 tanto en macrófagos F4/80+ acumulados como en células epiteliales de tipo salvaje desafiados por A. fumigatus (Fig. 5a i-ii) en comparación con la expresión de NLRP3 principalmente en el epitelio. células de ratones GM-CSF -/- desafiados con A. fumigatus (Fig. 5b, i – ii). El análisis morfométrico confirmó una cantidad significativamente menor de células NLRP3/+F4/80+ (Fig. 5c). De manera similar, también analizamos la expresión de NLRP3 e IL-18 en ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus y ratones GM-CSF -/- utilizando análisis de inmunofluorescencia anti-NLRP3 y anti-IL-18 en las secciones de tejido esofágico. El análisis detectó células NLRP3+IL-18+ acumuladas en los macrófagos acumulados y células epiteliales de ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus (Fig. 5d, i–ii) en comparación con NLRP3+IL-18+ principalmente en el epitelio. células de ratones GM-CSF -/- desafiados con A. fumigatus (Fig. 5e, i – ii). El análisis morfométrico mostró células NLRP3+ IL-18+ significativamente reducidas (Fig. 5f). La inmunotinción Anti-MBP y anti-Ki-67 detectó mayores eosinófilos MBP+ y células epiteliales Ki-67+ en ratones desafiados con A. fumigatus de tipo salvaje (Fig. 5g, j, i – ii) en comparación con GM-CSF-. /- de ratones desafiados por A. fumigatus (Fig. 5h, k, i – ii). La cuantificación morfométrica mostró que las células MBP + y KI-67 + se redujeron significativamente en ratones GM-CSF -/- desafiados con A. fumigatus en comparación con ratones de tipo salvaje desafiados con A. fumigatus (Fig. 5i, l). Además, también examinamos que en ratones GM-CSF-/- las células epiteliales son la fuente de NLRP3 e IL-18; por lo tanto, para confirmar, primero inmunoteñimos las secciones de tejido esofágico con anti-citoqueratina, anti-NLRP3 y anti-IL-18. El análisis mostró que todos los ratones expuestos a A. fumigatus mostraron expresión de células epiteliales anti-citoqueratina+ con expresión inducida de NLRP3 en secciones de tejido montadas con DAPI (Fig. 5m, i-iv), y de manera similar expresión de IL-18 en células epiteliales anti-citoqueratina+ en Secciones de tejido montadas con DAPI (Fig. 5n, i – iv). Además, presentamos un análisis de inmunofluorescencia individual detallado de anti-NLRP3 y anti-F4/80 (Fig. S5a – d, i – iv) y anti-NLRP3 y anti-IL-18 en las secciones de tejido esofágico de solución salina y A. ratones desafiados con fumigatus (Fig. S5e – h, i – iv). Estos análisis indicaron que la deficiencia de macrófagos maduros no es suficiente para proteger a los ratones de la inducción de EEo experimental, ya que las células epiteliales esofágicas también expresan IL-18 regulada por NLRP3 inducida en EEo inducida por alérgenos.

Una fotomicrografía representativa de la expresión inducida de NLRP3 en macrófagos F4/80+ y células epiteliales en secciones de tejido esofágico de ratones de tipo salvaje expuestos a A. fumigatus (a, i–ii) en comparación con ratones GM-CSF-/-; Se detectaron muy pocas o ninguna célula F4/80+ en ratones GM-CSF-/- (b, i-ii). La expresión de IL-18 en macrófagos F4/80+ y células epiteliales se detectó en secciones de tejido esofágico de ratones de tipo salvaje expuestos a A. fumigatus (d, i–ii) en comparación con ratones GM-CSF-/-; Se detectaron muy pocas o ninguna célula IL-18+F4/80+ en ratones GM-CSF-/- (e, i-ii). Se muestra el análisis de cuantificación morfométrica de NLRP3+/F4/80+ y NLRP3+/IL-18+ (c, f). Se muestra una microfotografía representativa de eosinófilos positivos anti-MBP en secciones esofágicas de ratones de tipo salvaje desafiados con solución salina y A. fumigatus (g, i–ii) y ratones GM-CSF-/- (h, i-iii) con análisis morfométrico de eosinófilos (i). La proliferación de células epiteliales Ki-67+ se muestra en ratones de tipo salvaje (j, i-ii) y GM-CSF-/- desafiados (k, i-ii) con solución salina o A. fumigatus con análisis morfométrico (l). Los ratones GM-CSF expuestos a secciones esofágicas de A. fumigatus muestran células positivas anti-citoqueratina que expresan NLRP3 en microfotografías fusionadas con DAPI (m, i-iv) y células positivas anti-citoqueratina que expresan IL-18 en microfotografías fusionadas con DAPI (n, i-iv) ). Los datos se expresan como media ± DE, n = 6–8 ratones/grupo. *p < 0,05; **p<0,001; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Las fotomicrografías presentadas tienen un aumento original de ×400 (barra de escala de 20 µm). Epitelio EP, lámina propia LP, mucosa muscular MS, luz LU.

A continuación, nos propusimos investigar si un mecanismo similar mediado por IL-18 regulado por NLRP3 y caspasa1 es operativo en la EEo humana. Por lo tanto, examinamos la expresión de NLRP3, caspasa1 e IL-18 en biopsias de individuos sanos y pacientes con EEo activa mediante análisis de inmunofluorescencia anti-citoqueratina, anti-NLRP3, anti-caspasa1 y anti-CD163. El análisis detectó células epiteliales con tinción de inmunofluorescencia anti-citoqueratina y muestra muy pocas células anti-citoqueratina+ NLRP3+, macrófagos anti-NLRP3+CD163+, células anti-NLRP3+caspasa1+ y anti-NLRP3+IL-18+ en biopsias de pacientes normales (Fig. 6a). –d, i) en comparación con la expresión inducida de células anti-citoqueratina+ NLRP3+, macrófagos anti-NLRP3+CD163+, células anti-NLRP3+caspasa1+ y anti-NLRP3+IL-18+ en las biopsias de EoE humana activa (Fig. 6a –d,ii). Los análisis morfométricos indicaron niveles significativamente más altos de células anti-CD163+, anti-NLRP3+, anti-caspasa1+ y anti-IL-18+ en pacientes con EEo en comparación con individuos sin EEo (Fig. 6a-d, iii). En la Fig. S6 se muestra la inmunofluorescencia individual detallada de anti-CD163+, anti-NLRP3+, anti-caspasa1+, anti-citoqueratina+ y anti-IL-18+. Para confirmar que las biopsias analizadas procedían efectivamente de pacientes con EEo activa, realizamos un análisis de inmunotinción anti-EPX y encontramos recuentos elevados de eosinófilos esofágicos intactos (flecha amarilla) y gránulos eosinofílicos extracelulares (flechas azules) en biopsias de pacientes con EEo activa en comparación con eosinófilos no detectables. en individuos normales en las secciones de tejido (Fig. 6e, i – ii). El análisis morfométrico detectó eosinófilos anti-EPX estadísticamente significativos (~100 veces) en biopsias de pacientes con EoE en comparación con los controles (Fig. 6e, iii). El análisis ELISA detectó niveles altos de IL-18, que se correlacionaron con la eosinofilia tisular (Fig. 6f). El análisis de PCR en tiempo real reveló niveles elevados de transcripción de CD163, NLRP3 y caspasa-1 del ARN tisular en EE humana activa en comparación con biopsias normales (Fig. 6g).

Fotomicrografía representativa del análisis de inmunofluorescencia que muestra la expresión inducida de NLRP3 en células epiteliales de citoqueratina+ (a, i–ii), poca expresión de NLRP3 doble positiva en macrófagos CD163+ (b, i–ii), expresión de NLRP3+ en células caspasa1+ (c, i–ii) y la inducción de NLRP3 + IL-18 (d, i – ii) en la mucosa epitelial esofágica en biopsias de pacientes con EoE en comparación con biopsias de individuos normales. El análisis de cuantificación morfométrica se expresa como células/mm2 para NLRP3+/Citoqueratina+ (a, iii), NLRP3+/CD163+ (b, iii) y NLRP3+/caspasa-1+ (c, iii), NLRP3+Il-18+ (d, iii). El análisis de inmunotinción Anti-EPX mostró eosinófilos intactos y gránulos eosinófilos extracelulares de EPX+ en biopsias de pacientes con EoE en comparación con los controles (e, i-ii). Análisis morfométrico para células EPX+, n = 8 (e, iii). Encontramos una correlación significativa entre los eosinófilos y la IL-18, n = 22 (f). El análisis por RT-PCR indicó niveles de expresión significativamente más altos de NLRP3, CD163 e IL-18 en pacientes con EEo en comparación con los controles (n = 9 biopsias) (g). Los datos se expresan como media ± DE. *p < 0,05; **p<0,001; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Las fotomicrografías presentadas tienen aumentos originales de ×100 y ×400 (barra de escala de 5 µm y 20 µm). Epitelio EP.

Desde entonces, el sistema inmunológico innato, los macrófagos y las células epiteliales están equipados con el inflamasoma NLRP3 que regula la IL-1823. Se informa que la IL-18 genera y transforma eosinófilos vírgenes generados por IL-5 en eosinófilos patógenos18. Por lo tanto, determinar si los inhibidores de NLRP3 se pueden utilizar como una nueva opción terapéutica para prevenir la patogénesis de EEo inducida por alérgenos. En consecuencia, examinamos los efectos de dos inhibidores de NLRP3 inyectados por vía intraperitoneal, β-hidroxibutirato (BHB) y MCC950, en nuestro modelo murino de EoE experimental desafiado por A. fumigatus. Se muestra una representación esquemática del protocolo de tratamiento con inhibidores para aeroalérgenos (Aspergillus fumigatus) y modelo murino inducido por EoE experimental desafiado con maíz sensibilizado (Fig. S7a, b; creado con BioRender.com). Los ratones tratados con ambos inhibidores (MCC950 y BHB) redujeron la expresión anti-NLRP3 en células epiteliales y macrófagos después de la exposición a A. fumigatus (Fig. 7a, i-vi) en comparación con los ratones que recibieron solución salina (Fig. 7a, iv). El análisis morfométrico confirmó que después de la exposición a A. fumigatus, los ratones con MMC950 o BHB habían reducido significativamente la expresión de NLRP3 en células epiteliales e IL-18+ en comparación con los inyectados con solución salina (Fig. 7b). De manera similar, también observamos el efecto del inhibidor de caspasa1 NLRP3, Belnacasan (VX-765), en la EoE experimental inducida por A. fumigatus. Encontramos una expresión marcadamente reducida de anti-caspasa1 y anti-IL-18 en macrófagos y células epiteliales F4/80+ en ratones expuestos a A. fumigatus tratados con VX-765 en comparación con ratones expuestos a A. fumigatus que recibieron solución salina (Fig. 7c, d, i–ii). El análisis morfométrico mostró una expresión de caspasa-1 significativamente reducida en células epiteliales y macrófagos IL-18+ (Fig. 7e). Además, la expresión reducida de NLRP3 se asocia con una reducción significativa en la acumulación de eosinófilos en el esófago de ratones desafiados con A. fumigatus para MCC950, BHB y VX-765 en comparación con los controles (Fig. 7f, i-viii). La cuantificación morfométrica indicó una reducción significativa en los eosinófilos anti-MBP+ en ratones desafiados con A. fumigatus tratados con inhibidor de NLRP3 (MCC950, BHB y VX-765) en comparación con ratones desafiados con A. fumigatus tratados con solución salina (Fig. 7g). Se observó una reducción similar de eosinófilos en secciones de tejido esofágico tratadas con maíz y MCC950 después de ratones tratados con anti-MBP en comparación con ratones tratados con Aspergillus solo (Fig. 7h). Se observó una reducción estadísticamente significativa en el número de eosinófilos (Fig. 7i). Además, también analizamos los niveles de citocina IL-18 mediante ELISA que muestra una reducción significativa en ratones expuestos a A. fumigatus y tratados con ratones MCC950 en comparación con ratones expuestos a A. fumigatus tratados con solución salina (Fig. 7j). Además, realizamos un análisis de transferencia Western para validar la inmunofluorescencia y la inmunotinción y encontramos NLRP3, pNLRP3, pro y caspasa1 madura, IL-18 activa e inactiva, proteína granular eosinófila EPX y TGF-β asociado a fibrosis en el esófago de Aspergillus. -ratones desafiados tratados con MCC950 en comparación con aquellos tratados con solución salina (Fig. 7k). Sin embargo, nuestro análisis observó cierta variación en los niveles de IL-18 del grupo de ratones MCC950 entre ELISA en comparación con los análisis de transferencia Western; pero tenga en cuenta que no se observaron diferencias significativas entre los dos grupos de ratones de control de solución salina y los tratados con MCC950 mediante análisis ELISA. La variación en el análisis ELISA puede deberse a algún error técnico o manual durante el lavado de la placa debido a las partículas de tejido atrapadas en los pocillos de la placa ELISA de un grupo en particular. Además, también examinamos los detalles de la inmunotinción individual de la proliferación de células epiteliales esofágicas anti-Ki-67 y de las células de citocina profibróticas TGF-β+ en ratones expuestos a A. fumigatus tratados con MCC950, BHB y VX-765 en comparación con ratones que recibieron solución salina y mostramos células TGF-β + y Ki-67 + estadísticamente significativas en secciones de tejido esofágico como células / mm2 (Fig. S7b, d, f, h, i, i – iii; c, e, g, i). Además, también presentamos un detalle del análisis de inmunofluorescencia anti-NLRP3 y anti-IL-18+ individual de los siguientes ratones desafiados con solución salina, A. fumigatus y A. fumigatus tratados con MCC950 y BHB (Fig. S8a-f, i-iv). Detalles del análisis de inmunofluorescencia individual anti-NLRP3 y anti-F4/80+ de los siguientes ratones desafiados con solución salina, maíz y maíz tratados con MCC950 (Fig. S8g – i, i – iv), y anti-NLRP3 y anti-IL-18 + análisis de inmunofluorescencia de los siguientes ratones con solución salina, maíz y desafíos con maíz tratados con MCC950 (Fig. S8j-l, i-iv). Además, también se proporcionan los detalles de inmunofluorescencia para moléculas individuales anti-caspasa1 y anti-IL-18 tratadas con solución salina, A. fumigatus y A. fumigatus con VX-765 (Fig. S9a – d, i – iv).

Una fotomicrografía representativa del análisis de inmunofluorescencia de células doblemente positivas para NLRP3 e IL-18 en secciones de tejido esofágico de ratones expuestos a solución salina y A. fumigatus expuestos (a, i, iv). Una disminución del nivel de células doble positivas de NLRP3 e IL-18 en ratones desafiados con A. fumigatus tratados con MCC950 (a, ii, v) BHB (a, iii, vi) y la cuantificación morfométrica mostraron niveles disminuidos estadísticamente significativos de NLRP3. Células +IL-18+ por antagonista del tratamiento con NLRP3 (b). La fotomicrografía de inmunofluorescencia mostró una disminución similar de células NLRP3+IL-18+ por el inhibidor de caspasa1 VX-765 en comparación con los controles (c, i–ii, d, i–ii). Los análisis morfométricos muestran una disminución estadísticamente significativa en las células NLRP3+IL-18+ en ratones expuestos a A. fumigatus en comparación con ratones expuestos a A. fumigatus tratados con el inhibidor de caspasa1 (e). Una fotomicrografía representativa de eosinófilos Anti-MBP+ de secciones esofágicas de ratones expuestos a solución salina (f, i) MCC950 (f, ii), BHB (f, iii) y VX-765 (f, iv) y Aspergillus expuestos (f, v) Se muestran A. fumigatus + MCC950 (f, vi), A. fumigatus + BHB (f, vii) y A. fumigatus + VX-765 (f, viii). Los análisis morfométricos muestran una disminución significativa de los eosinófilos anti-MBP+ en ratones expuestos a A. fumigatus en comparación con los tratados con inhibidores de NLRP3, MCC950, BHB y VX-765 (g). Una fotomicrografía representativa de los niveles de eosinófilos MBP+ en ratones expuestos a extracto de maíz salino y ratones tratados con maíz tratado con MCC950 (h, i-iii) con análisis de cuantificación morfométrica (i). Estimación de IL-18 mediante ELISA en muestras de tejido esofágico, expresada como pg/mg de tejido (j). Se presentan los análisis de transferencia Western de NLRP3-IL-18-caspasa-1, IL-18, EPX y TGFβ (k). Los datos se expresan como media ± DE, n = 6–8 ratones/grupo. *p < 0,05; **p<0,001; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Todas las microfotografías mostradas tienen un aumento original de ×400 (barra de escala de 20 µm). Epitelio EP, lámina propia LP, mucosa muscular MS, luz LU.

La esofagitis eosinofílica (EoE) fue reconocida por primera vez como un síndrome clínico y patológico distinto en la década de 199030. Desde entonces, se ha convertido en una causa común de síntomas esofágicos como disfagia, impactación del bolo alimentario, pirosis, vómitos, regurgitación y odinofagia. Las estimaciones de su prevalencia global oscilan entre 0,5 y 1 caso por cada 1.000 personas en todo el mundo31. La EEo es cada vez más común, con alrededor de 5 a 10 casos nuevos por cada 100.000 personas cada año32, pero no hay terapias confiables disponibles. La evidencia indica que las células inflamatorias inducidas por aeroalérgenos, alérgenos de insectos y alérgenos alimentarios tienen un papel importante en la patogénesis de la EEo2,29,33. La FDA aprobó recientemente la terapia con el anticuerpo IL-4Rα dupilumab, que mejora algunos síntomas de EEo, pero aún no se han publicado datos detallados. Sus efectos sobre la patogénesis de la EEo no son sorprendentes, ya que dupilumab (anti-IL-4Rα) reduce las características de los macrófagos M2, incluido un cambio en la expresión de proteínas marcadoras de la superficie celular y la expresión génica34. La IL-13 regulada por IL-5 se une a IL-4Rα, que tiene un papel importante en la supervivencia de los eosinófilos y la progresión de la patogénesis35. Esto respalda aún más nuestros hallazgos de que las respuestas inducidas por macrófagos/células epiteliales tienen un papel en el inicio y la progresión de la patogénesis de la EoE. Algunos factores previamente implicados en la patogénesis de la EEo incluyen citocinas inducidas por alérgenos (p. ej., IL-5, IL-13, IL-33), células epiteliales, quimiocinas derivadas de células nerviosas, inducción de eotaxina-3 y VIP, y factores genéticos15. ,17,36,37,38,39,40; sin embargo, aún no se ha demostrado que atacar estas citocinas Th2 bloquee con éxito la patogénesis de la EEo con alguna importancia clínica. Recientemente informamos que la IL-18 también tiene un papel crítico en la diferenciación y maduración de los eosinófilos patógenos que expresan CD274+CD101+18. A pesar de los importantes avances en la comprensión del desarrollo de algunos rasgos característicos de la EEo crónica, los factores mecanísticos responsables de la aparición de la EEo después de la exposición a alérgenos aún no se comprenden claramente. En el estudio actual, presentamos evidencia de que se requiere IL-18 para promover la patogénesis de EEo incluso en ratones CD2-IL-5, así como en ratones ΔdblGATA con deficiencia de eosinófilos tisulares. La rIL-18 administrada farmacológicamente a ratones CD2-IL-5 transformó los eosinófilos vírgenes en eosinofilia intraepitelial patógena y gránulos eosinófilos extracelulares desgranulados. Sin embargo, la inmunotinción detectó eosinofilia esofágica comparable en ratones con rIL-18 que recibieron CD2-IL-5 y ΔdblGATA. Sin embargo. el análisis de transferencia Western indicó proteína granular eosinófila inducida en rIL-18 a los que se les administró ratones CD2-IL-5, lo que indica que la IL-5 genera eosinófilos vírgenes en combinación con IL-18 que genera y madura eosinófilos patógenos. Estos datos son consistentes con nuestro informe anterior de que la IL-18 in vitro por sí sola es capaz de generar e incluso transformar eosinófilos generados por IL-5 vírgenes en eosinófilos patógenos17, lo que sugiere que la IL-18 es fundamental y puede explicar por qué la EEo no se trata eficazmente con anti-Eo. Terapia con IL-5 (mepolizumab) o anti-IL-13. La IL-5 no es un iniciador de la EEo sino un factor de supervivencia para los eosinófilos41. Además, se ha informado que las quimiocinas eotaxina-3 desempeñan un papel en la patogénesis de la EE humana; sin embargo, la eotaxina-3 no se detecta en ratones. Sin embargo, la mucosa esofágica acumula eosinófilos en ratones ΔdblGATA y CD2-IL-5 después de la administración farmacológica de rIL-18. Informes anteriores también indicaron que la eotaxina está altamente inducida en el esófago ingenuo, pero carece de eosinófilos, lo que indica un papel limitado de la eotaxina-3 en la patogénesis de la EEo42. Además, la terapia anti-IL-5 también plantea preocupaciones con respecto a los efectos del tratamiento a largo plazo sobre la biología de los eosinófilos y su importancia en el mantenimiento de la inmunidad innata43. Es importante comprender las consecuencias del agotamiento de eosinófilos después de la terapia anti-IL-5 en la defensa natural innata del huésped humano. Los ratones con deficiencia de eosinófilos y el gen IL-5 y los ratones con deficiencia del gen GATA1 desarrollan eosinofilia tisular después de la inducción de la enfermedad en modelos experimentales18,43,44. Los ratones GM-CSF-/- desarrollan algunos defectos autoinmunes e incluso si rescatamos GM-CSF-/- mediante la adición de r-GM-CSF; No obtendremos ninguna información adicional relacionada con la información necesaria y es la limitación del estudio actual. Un informe reciente indicó que estos ratones tienen tasas de reproducción lentas, producen un número reducido de crías y pierden capacidad de reproducción mucho antes que los ratones normales43. Está bien establecido que la IL-4 es fundamental para funciones superiores del cerebro normal, como la memoria y el aprendizaje45; por lo tanto, se debe examinar cuidadosamente el efecto a largo plazo asociado con la edad del Dupixent (anti-IL4Rα) aprobado por la FDA para el tratamiento de la EoE. La inhibición de citoquinas como IL-5 e IL-4 puede comprometer la inmunidad innata de los pacientes pediátricos con EEo, cuyos sistemas inmunológicos innatos aún se encuentran en etapa de desarrollo46.

También se han informado niveles elevados de IL-18 en EEo humana y experimental inducida por alérgenos37,47. Hemos demostrado que tanto la exposición a Aspergillus como al extracto de maíz inducen NLRP3 y caspasa1 en células epiteliales esofágicas y macrófagos inflamatorios acumulados en modelos murinos de EEo. Estos hallazgos son consistentes con los informes que indican que la activación de NLRP3 y caspasa1 induce IL-1848,49. Proporcionamos evidencia de una vía mecanística de IL-18 regulada por NLRP3 y caspasa1 similar después de la EoE inducida por alérgenos en ratones. La vía NLRP3-caspasa inducida por alérgenos también induce IL-1β, pero esta citocina no participa en la generación o maduración de eosinófilos; por lo tanto, no se realiza ningún estudio sobre el papel de la IL-1β en el inicio y la progresión de la EEo. Esta IL-18 inducida promueve la acumulación y desgranulación de eosinófilos en los tejidos y contribuye al desarrollo de la patogénesis de la EEo, incluida la remodelación y la fibrosis. También mostramos la evidencia de que una vía mecanística similar de NLRP-3-caspasa-1-IL-18 está operativa en la EoE humana. Además, también proporcionamos evidencia de que la administración de IL-18 promueve la patogénesis de la EEo incluso en ratones ΔdblGATA con deficiencia de sangre y tejido que no tienen eosinófilos tisulares pero solo tienen precursores de eosinófilos en la médula ósea. Es importante destacar que presentamos evidencia directa de que la neutralización de IL-18 o la deficiencia de IL-18 en ratones restringe la formación de la mayoría de las características patológicas observadas en la EEo, y que el tratamiento con inhibidores de NLRP3 o caspasa1 protege a los ratones del desarrollo de EEo inducida por aeroalérgenos o alérgenos alimentarios. .

Reconocemos que existen algunas limitaciones en los modelos experimentales de ratones que incluyen la inoculación intranasal o intravascular de alérgenos o citoquinas; pero los modelos están bien establecidos e imitan fielmente la EE humana. Las características de EEo incluyen acumulación de macrófagos esofágicos, activación de NLRP3 y caspasa1, y la presencia de subconjuntos de eosinófilos IL-18 y CD274+, células intraepiteliales, proliferación de células epiteliales y fibrosis. Dada la escasez de información mecanicista y estrategias de tratamiento para la EEo, creemos que los estudios propuestos son muy relevantes y están preparados para tener un impacto importante en el establecimiento de la importancia de la vía NLRP3-IL-18 en el inicio de la patogénesis de la EEo.

Presentamos evidencia suficiente para establecer el papel crítico de la IL-18 en la aparición de la EEo y mostramos que el tratamiento previo con inhibidores de NLRP3 y caspasa1 como MCC950, BHB y VX-765 protege la patogénesis de la EEo inducida tanto por alérgenos alimentarios como por aeroalérgenos en la EEo experimental. modelo. Primero, mostramos que la IL-18 regulada por NLRP3 inducida por células epiteliales y macrófagos es mecánicamente crítica en la promoción de la EoE inducida por aeroalérgenos y alérgenos alimentarios, que está de acuerdo con la IL-18 inducida previamente informada en la EoE humana15. En segundo lugar, demostramos que la sobreexpresión de IL-18 promueve la patogénesis de la EoE, incluida la proliferación de eosinófilos intraepiteliales y células epiteliales, en ratones ΔdblGATA con deficiencia de eosinófilos tisulares y ratones eosinófilos globales CD2-IL5. Estos datos respaldan hallazgos previos de que la IL-18 diferencia y transforma los eosinófilos vírgenes generados por la IL-5 en eosinófilos patógenos17. En tercer lugar, presentamos evidencia de que la deficiencia de IL-18 y la neutralización de IL-18 protegen la EEo inducida por alérgenos, lo que respalda hallazgos previos de que la neutralización de las células iNKT tiene un papel crítico en la EEo inducida por alérgenos, ya que la IL-18 activa las células iNKT para inducen el crecimiento de eosinófilos y las citoquinas de supervivencia IL-5 e IL-1350. En cuarto lugar, mostramos que NLRP3-caspasa1 e IL-18 se inducen en biopsias de EoE humanas en comparación con individuos normales, lo que indica que opera un mecanismo similar en la EoE humana. Por último, mostramos que apuntar a inhibidores neutralizados de IL-18, NLRP3 y caspasa1 es una nueva estrategia terapéutica para la EEo humana.

La evidencia presentada en el estudio actual es novedosa y clínicamente importante para los pacientes con EoE, particularmente los niños que padecen la enfermedad. Este enfoque merece atención inmediata y ensayos clínicos multicéntricos doble ciego en humanos que utilicen inhibidores de NLRP3 y caspasa-1. VX-765, un profármaco de VRT-043198 que se absorbe por vía oral, es un inhibidor potente y selectivo de la subfamilia ICE/caspasa1 y está disponible para uso humano, lo que lo convierte en un candidato ideal para ensayos en humanos dirigidos a la EoE a través de caspasa1 NLRP3 en sentido descendente. De manera relevante, los ensayos clínicos propuestos son importantes en vista de que se dirigen únicamente a los eosinófilos patógenos maduros y generados por IL-18 y no afectarán a los eosinófilos generados por IL-5 necesarios para mantener la inmunidad innata. Presentamos un diagrama mecanicista esquemático resumido que involucra NLRP3 y IL-18 regulada por caspasa1 para la patogénesis de EEo (Fig. 8).

El alérgeno tomado por macrófagos y células epiteliales induce que la IL-18 genera eosinófilos patógenos y la IL-15 sensible a la IL-18 activada por células iNKT derivadas de IL-5 es necesaria para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación de los eosinófilos patógenos, lo racional se basa en el agotamiento de los eosinófilos. mediante neutralización de células iNKT y datos actuales de EEo inducida por IL-18. Los eosinófilos patógenos derivados de IL-18 son la fuente del TGF-β que promueve la patogénesis de la EEo, incluida la remodelación y la fibrosis. Además, NLRP3 y los inhibidores de caspasa como MCC950, BHB y VX-765 parecen bloquear la producción de IL-18, lo que reduce la acumulación de patogénesis de EEo mediada por eosinófilos patógenos. Creado con BioRender.com.

Ratones Balb/c, C57BL/6, GM-CSF-/- e IL-18-/- (Balb/c), la mayoría de los ratones se mantienen en nuestro laboratorio, excepto los ratones con deficiencia del gen GM-CSF que se obtuvieron del Jackson Laboratory y alojado en un ambiente libre de patógenos. Todas las investigaciones se llevaron a cabo en ratones de 6 a 8 semanas de edad y sexo iguales. Los métodos con animales siguieron las recomendaciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Tulane (IACUC). Según la disponibilidad de los ratones con deficiencia genética correspondiente, utilizamos cepas de ratones C57BL/6 o Balb/c.

Las biopsias de tejido se obtuvieron del Centro de Trastornos Eosinofílicos de Tulane y de la Facultad de Medicina de la Universidad de Vanderbilt. Las biopsias de EoE humanas se evaluaron utilizando datos recopilados de ambos centros y combinados. Los pacientes con EoE fueron fenotipados según los hallazgos endoscópicos empleando la puntuación de referencia endoscópica de EoE (EREFS), una herramienta endoscópica validada para distinguir las condiciones con EoE de las que no lo son. Según las pautas AGREE 2018, un recuento de eosinófilos de ≥15/HPF (campo de alta potencia) en al menos una de las múltiples muestras de biopsia esofágica tomadas de diferentes ubicaciones es clínicamente indicativo de EEo. Se excluyó a los pacientes si habían sido diagnosticados previamente con cualquier otro tipo de enfermedad inflamatoria gastrointestinal o sistémica además del trastorno gastrointestinal eosinofílico. Siguiendo una metodología aprobada por el IRB, se incluyeron pacientes con síntomas de EEo en la investigación de biomarcadores. Los detalles de los pacientes se proporcionan en la Tabla complementaria 1.

La EEo se indujo en el laboratorio utilizando procedimientos bien establecidos de exposición a Aspergillus fumigatus51 o alérgenos de maíz29, como se describe en nuestro manuscrito publicado anteriormente. Se emplearon metodologías establecidas para estudiar el papel de los macrófagos en el modelo de ratón con EEo empleando C57BL/6 o Balb/c, GM-CSF-/-, IL-18-/- y sus correspondientes cepas de ratones de control51. Se utilizaron micropipetas para administrar 100 µg de extracto de Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) o solución salina normal (50 µl) a los ratones, que se mantuvieron en postura horizontal mientras estaban sedados con isoflurano (Iso-Flo; Abbott Laboratories, North Chicago, ILLINOIS). Los ratones se sacrificaron entre 18 y 20 h después de la última exposición al alérgeno intranasal o a la solución salina después de 3 semanas de tres pruebas por semana. Además, se indujo un modelo de ratón de EEo inducida por alérgenos de maíz en ratones ligeramente anestesiados con isoflurano (Iso-Flo; Abbott Laboratories, North Chicago, IL) y se sensibilizó con 200 μg de extracto de maíz (Greer Laboratories, Lenoir, NC) con 1 mg de alumbre el día 0 y el día 14 mediante inyección intraperitoneal (IP). El día 21, los ratones se dividieron en cuatro grupos. Dos grupos fueron tratados por vía intranasal con 100 μg (50 μl) de extracto de maíz (Greer Laboratories) o 50 μl de solución salina normal sola los días 21, 23 y 25 usando una micropipeta y fueron sacrificados 20 a 24 h después del último alérgeno o solución salina. desafío. Se utilizó el mismo protocolo para los dos inhibidores de NLRP3 en una dosis de 10 mg/kg/semana para MCC950 y 250 mg/kg para BHB junto con Aspergillus fumigatus o extracto de maíz.

Se administró rIL-18 (10 µg) a ratones Balb/c y deficientes en GATA1 durante un período de 2 semanas. Se administraron un total de seis inyecciones intravenosas (iv), después de lo cual se sacrificaron los ratones y se recogió el esófago para estudios adicionales.

Antes de la exposición al extracto de Aspergillus (100 µg), los ratones recibieron Anti-IL-18 Clone YIGIF74-1G7 por vía intraperitoneal (200 µg, dos veces por semana durante 3 semanas) (Bio X Cell, West Lebanon, NH).

Para eliminar todas las células epiteliales y linfocitos intraepiteliales, el esófago se abrió longitudinalmente y se trató con PBS en un agitador orbital a 250 rpm durante 2 a 3 veces durante 20 minutos a 37 °C. Luego, las tiras esofágicas se cortarán y se digerirán en una placa Patri con 10 ml de solución de colagenasa VIII/ADNasa I precalentada. Mantenga el plato horizontalmente en un agitador orbital y digiera los esófagos durante 10 a 20 minutos a 37 ° C a 200 rpm. Para garantizar una disociación completa, agite los esófagos residuales durante 5 a 10 s antes de filtrar a través de un colador de células de 100 m directamente en un tubo cónico de 50 ml. Luego, agregue CMF HBSS/FBS al tubo cónico de 50 ml y centrifugue durante 5 minutos a 4 ° C a 1500 rpm. La etapa de lavado con CMF HBSS/FBS se repitió una vez más y luego se extrajeron los glóbulos rojos del sedimento celular usando tampón de lisis RBC (Sigma). Resuspendimos los sedimentos celulares en CMF, HBSS/FBS helado después de retirar el sobrenadante y los pusimos en hielo durante algún tiempo. Para el análisis, los macrófagos se cultivaron durante la noche y se trataron con rIL-18.

Los ratones fueron sacrificados y se eliminó el esófago de proximal a distal. Cada esófago se abrió longitudinalmente, se lavó con PBS libre de Ca y Mg, pH 7,2, y se cortó en trozos pequeños que posteriormente se combinaron. El tejido combinado se incubó durante 40 minutos en 2 ml de medio de cultivo de tejidos RPMI (GIBCO) con 0,5 mg/ml de cloruro de liberasa (Rush Biochemicals) en CO2 al 0,5 % a 370 °C. Después de la digestión, se aislaron células individuales y se filtraron a través de un filtro celular de 70 µm seguido de un filtro celular de 40 µm (BD Falcon). Las células se centrifugaron a 250 xg durante 5 minutos y los sedimentos celulares se resuspendieron en el medio y se contaron.

El esófago se homogeneizó y solubilizó en reactivo de extracción de proteínas (Thermo Fisher Scientific, 78510) que contenía un cóctel de inhibidor de proteasa e inhibidor de fosfatasa (Thermo Fisher Scientific, A32953). Las proteínas (30 μg) se resolvieron en gel MP TGX al 4-15% (Bio-Rad) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore). Los anticuerpos utilizados se enumeraron: anti-NLRP3 de conejo (1:1000, Cell Signaling Technology, 15101S), anti-pNLRP3 de conejo (Phospho-Ser295) (1:1000, MyBioSource, Inc., MBS9430199), anti-caspasa- 1 anticuerpo (1:1000, Cell Signaling Technology, #24232S), anticuerpo anti-caspasa-1 (p20) (1:1000, Adipogen life sciences, AG-20B-0042-C100), anticuerpo de conejo anti-IL-18 ( 1:1000, Biorbyt, orb345221), anticuerpo anti-EPX (1:1000, Mayo Clinic, 662008-1003), anticuerpo anti-IL-1β (1:1000, Cell Signaling Technology, #12242), anticuerpo anti-TGFβ ( 1:1000, Tecnología de señalización celular, 3711S) y ani-GAPDH de conejo (1:1000, Tecnología de señalización celular, 5174S).

Como se publicó anteriormente, se inmunotiñeron cortes de tejido esofágico incluidos en parafina (5 µm) con antisuero contra la proteína básica principal de los eosinófilos de ratón (anti-MBP)52. En resumen, la peroxidasa endógena se inactivó en los tejidos utilizando peróxido de hidrógeno al 0,3% en metanol, seguido de un bloqueo de proteínas no específico utilizando suero de cabra normal al 3%. Luego, los cortes de tejido se trataron durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-MBP de rata (dilución 1:1000) (Mayo Clinic, Scottsdale, AZ), seguido de 1 h de incubación con una dilución 1:250 de IgG secundaria anti-rata de cabra biotinilada. anticuerpo y complejo avidina-peroxidasa (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se utilizó DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para desarrollar aún más los portaobjetos y se utilizó rojo nuclear rápido como contratinción. Las muestras fueron desparafinadas y montadas con medios de montaje. La cantidad de eosinófilos y el tamaño del segmento de tejido se cuantificaron y calcularon mediante análisis morfométrico digital (Lumenera Corporation, Infinity Analyze 61.0) y se expresaron como eosinófilos/mm2.

Se utilizó tinción inmunohistoquímica de cortes de tejido de ratón (5 µm) para identificar antígenos proteicos específicos en el esófago. La peroxidasa endógena se bloqueó incubando secciones en H2O2 al 3,0% en metanol durante 20 minutos antes de bloquear con suero de cabra al 3,0% durante una hora a temperatura ambiente. Se utilizaron tres anticuerpos primarios: TGF-β (1:200, sc-146, Santa Cruz), Ki-47 (1:200, D3B5, CST). Luego, las secciones se incubaron a 4 °C durante la noche con los anticuerpos primarios. Después de una hora adicional de incubación con los correspondientes anticuerpos secundarios biotinilados, las secciones se revelaron con DAB (laboratorios de vectores), se contratiñeron con rojo nuclear rápido y se montaron con medios de montaje antes de analizarlas. Para la obtención de imágenes se utilizó un microscopio óptico Olympus BX43 (Tokio, Japón).

Se desparafinaron y deshidrataron secciones de tejido de esófago de ratón incluido en parafina (5 m), y se realizó la tinción como se informó anteriormente53. La recuperación del antígeno se realizó utilizando el método de solución desenmascaradora de antígenos a base de ácido cítrico (Vector labs), seguido del bloqueo con suero de cabra normal al 5% para reducir la unión no específica y la incubación con anticuerpos primarios específicos: anti-F4/80 (1:200). , Tecnología de señalización celular, 30325S); Anti-NLRP3 de conejo (1:200, tecnología de señalización celular, 15101S); anti-IL-18 (1:200, Invitrogen, HL1859); Anticuerpo anti-citoqueratina (1:400, tecnología de señalización celular, 4545). Se utilizó ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI para montar secciones inmunoteñidas (P36980, Thermo Fisher Scientific). Las fotografías se tomaron con un microscopio Olympus BX43 equipado con los filtros adecuados.

La tinción con colágeno se realizó en secciones de tejido utilizando el método de tinción tricrómica de Masson (Poly Scientific R&D) para detectar fibras de colágeno según las indicaciones del fabricante. Para obtener las imágenes se utilizó un microscopio Olympus BX43. El área positiva de colágeno se evaluó morfométricamente utilizando el software Olympus Cell Sens Dimension y se expresa en micrómetros cuadrados.

Para extraer ARNm de tejidos esofágicos, utilizamos el kit RNeasy Mini según el manual de instrucciones (217604, Qiagen, EE. UU.). Aproximadamente 500 ng de ARN se convirtieron en ADNc utilizando la transcriptasa inversa iscript (1708891, Bio-Rad, Hercules, CA). Se utilizó el sistema de PCR en tiempo real CFX96 para amplificar el ADNc utilizando la mezcla maestra de PCR verde SYBR (1725271, Bio-Rad, EE. UU.). Se utilizaron los siguientes cebadores: ARNr 18s F de ratón: GCAATTATTCCCCATGAACG, R: GGCCTCACTAAACCATCCAA; IL-4 de ratón F: CCTCACAGCAACGAAGAACA, R: CTGCAGCTCCATGAGAACAC; IL-5 de ratón F: TCAGCTGTGTCTGGGCCACT, R: TTATGAGTAGGGACAGGAAGCCTCA; IL-13 de ratón F: TGCTTGCCTTGGTGGTCTC, R: CAGGTCCACACTCCATACC; IL-18 de ratón F: CTGGCTGTGAACCCTCTCTGTGAAG, R: TGTCCTGGAACACGTTTCTGAAAG; ratón NLRP3 F: AGTGGATGGGTTTGCTGGGATA, R: CTGCGTGTAGCGACTGTTGAGGT; ratón F4/80 F: CTTTGGCTATGGGCTTCCAGTC, R: GCAAGGAGGACAGAGTTTATCGTG, CD163 humano F: ACATAGATCATGCATTCTGTCATTTG, R: CATTCTCCTTGGAATCTCACTTCTA, NLRP3 humano F: CTTCTCTGATGAGGCCCAAG, R: GCAGCAAACTGGAAAGGAAG; IL-18 humana F: GCTTGAATCTAAATTATCAGTC, R: CAAATTGCATCTTATTATCATG; GAPDH humano F: GGAAATCCATCACCATCT, R: GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT.

Los animales se distribuyeron al azar en diferentes grupos y se utilizaron al menos de 6 a 8 ratones para cada grupo. Los datos se presentan como media ± DE. Se utilizó la prueba t de Student para evaluaciones estadísticas de comparaciones de dos grupos. El análisis estadístico con más de dos grupos se realizó con análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software Prism (GraphPad prism para Windows, versión 8.0). Las diferencias se consideraron significativas en *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos generados o analizados durante este estudio se proporcionan en el artículo principal (Figs. 1 a 8) y en las figuras complementarias (Figs. 1 a 9 complementarias). Las imágenes de transferencia originales se muestran en las figuras complementarias. 10-13. Los datos de origen de los gráficos e imágenes se pueden encontrar en los archivos de Excel complementarios (Datos complementarios).

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AM es la Cátedra Schleiden; por lo tanto, agradecemos a la Fundación Educativa Edward G. Schleifer por su apoyo. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH) de EE. UU. (Subvención NIH R01 AI080581, AM). Los autores agradecen a Lunar Biotechnology, LLC por sus esfuerzos y colaboración en la realización de algunos experimentos. Los autores también agradecen a la Sra. Loula Burton, editora de la Oficina de Desarrollo de Propuestas de Investigación de la Universidad de Tulane por la revisión y edición del manuscrito.

Departamento de Medicina John W. Deming, Centro de Trastornos Eosinofílicos de Tulane (TEDC), Sección de Enfermedades Pulmonares, Facultad de Medicina de la Universidad de Tulane, Nueva Orleans, Luisiana, EE. UU.

Chandra Sekhar Yadavalli, Sathisha Upparahalli Venkateshaiah, Sandeep Kumar, Hemanth Kumar Kandikattu, Lokanatha Oruganti, Chandra Sekhar Kathera y Anil Mishra

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de Georgia, Universidad de Augusta, Augusta, GA, EE. UU.

Sandeep Kumar

Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina de la Universidad de Tulane, Nueva Orleans, Luisiana, EE. UU.

Lokanatha Oruganti

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CSY: generación de datos de ratones y análisis experimental, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, inmunotransferencia, ELISA y borrador inicial del manuscrito; SUV: generación y análisis de datos experimentales de tejido humano; SK: experimentos iniciales con ratones e inmunotinción de tejidos; LO: procesamiento de tejidos, corte de secciones y análisis ELISA; HKK: edición y revisión del manuscrito; CSK: análisis por PCR, edición de manuscritos; AM: conceptualización, planificación experimental, visualización, revisión, supervisión y provisión de fondos.

Correspondencia a Anil Mishra.

Los autores declaran que no conocen relaciones personales competitivas que pudieran haber influido en el trabajo presentado en este artículo. Sin embargo, AM presentó una patente para proteger el uso de un antagonista humanizado o anticuerpo de NLRP3-Caspasa1-IL-18 para atacar la patogénesis de la enfermedad asociada a los eosinófilos humanos.

Communications Biology agradece a Matt Johansen y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Joao Valente. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Yadavalli, CS, Upparahalli Venkateshaiah, S., Kumar, S. et al. La señalización de NLRP3/caspasa1/IL-18 inducida por alérgenos inicia la esofagitis eosinofílica y los inhibidores respectivos protegen la patogénesis de la enfermedad. Común Biol 6, 763 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05130-4

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Recibido: 05 de enero de 2023

Aceptado: 10 de julio de 2023

Publicado: 31 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05130-4

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